摘要：光學顯微成像技術具有實時、高分辨率和非侵入性等特點，其成像尺度可跨越細胞、組織乃至生命體，極大地拓展了人們對生命本質的認識邊界。然而，受限于光學顯微成像系統有限的空間帶寬積（Space-bandwidth Product，SBP），常規的光學顯微鏡難以同時兼顧視場大小和分辨率，使得顯微成像在大視場生物成像應用中受到較大的限制，例如對腦神經網絡以突觸為單位的神經回路成像。近年來，大視場光學顯微成像技術得到不斷的發展，其SBP相較于傳統的光學顯微鏡有了十倍甚至百倍的提升，在保持高分辨率的基礎上拓展了成像視場，滿足了生物醫學領域重大問題的研究需求。本文介紹了近年來幾種典型的大視場光學顯微成像技術及其生物醫學應用，并對其未來發展做了展望。

關鍵詞：光學顯微；空間帶寬積；大視場成像；活體成像

1. 引言

光學成像系統的信息通量常用空間帶寬積（Space-Bandwidth Product，SBP）來衡量，SBP是一個無量綱數，可以理解為系統視場（Field of view，FOV）內可分辨的像素點個數， SBP越大，系統可傳輸的信息就越豐富。常規的光學顯微鏡，其成像的SBP在數百萬量級。系統的SBP提升主要受兩個因素限制：一是探測器的像素尺寸和像素數量，目前隨著以sCMOS為代表的大尺寸高分辨率相機的發展，探測器的像素數已經可以達到2×107,像素尺寸1.5 μm，因此探測器已不再是系統SBP的瓶頸；二是成像光路，主要受制于顯微系統的成像物鏡。常用的商業顯微物鏡，其SBP在不考慮離軸像差影響的情況下，一般不超過107，因此提升成像光路的SBP是提升整個系統大視場光學顯微成像能力的有效途徑。

提升系統SBP的基本思路有兩種，簡單來說，就是在保持分辨率的基礎上，擴大視場；或者在維持視場的基礎上，提升分辨率。目前，光學顯微系統的分辨率分布在高至衍射極限的約200 nm，低至數個μm范圍內，由物鏡的數值孔徑（Numerical Aperture，NA）和工作波長λ決定。在實際應用中，分辨率可提升的范圍有限，以熒光顯微成像中的結構光照明技術（Structured Illumination Microscopy，SIM）為例，使用線性結構光照明樣品的方法最多可以將分辨率提升一倍，雖然使用非線性結構光可以實現更高的提升倍率，然而強烈的光損傷使這一方法并不常用，且實際可提升的倍數也有限。與之相似的還有傅里葉疊層顯微技術（Fourier Ptychography Microscopy，FPM），通過頻域多角度照明的方法實現視場內分辨率的數倍提升。因此，利用分辨率提升的措施使SBP達到十倍百倍的提升，并不現實。 而基于擴大成像視場，進而提高獲取圖像像素數的方法，已經得到了有效的驗證。一個常用的做法是用高NA，小視場的成像物鏡，對樣品做多次成像，再用二維互相關技術等將各子視場的圖像拼接，實現高分辨率的超大視場圖像獲取。這一方法在組織切片成像，病理診斷等領域已得到廣泛應用。拼接成像的優勢在于這一技術非常成熟，系統相對簡單。電動樣品位移臺可以實現樣品微米級精度的二維或三維移動，物鏡掃描系統和自動對焦算法也可以使物鏡在樣品每次移動后自動對焦并成像。因此無論是用現有顯微鏡改造，還是購置新品，實現拼接的大視場成像均不困難。然而，對于拼接成像技術，由于其每個子視場在時間上和空間上的采集都是離散的，因此需要更多的采集時間，這些時間更多的被用于樣品移動和物鏡對焦，而不是光子采集。長時間采樣時，來自溫度的變化或環境的振動有可能導致樣品離焦以及產生運動偽影，高NA的物鏡對于環境變化則更為敏感。此外，較長的采樣時間也限制了這一方法的應用范圍，如大視場的生物樣本實時動態檢測。

因此，提升分辨率或者是拼接成像的方法對成像系統SBP的提升都存在各自的弊端：前者的提升能力有限，難以滿足大視場光學顯微生物成像的需求；后者耗時太長，不適用于快速的在體觀測。一類有效的解決辦法是直接擴大成像視場來提升SBP，它可以在較短的時間內獲取高像素數圖像。需要注意的是，系統的SBP受空間分辨率和視場范圍影響，會決定單次成像的像素數上限，而系統的實際像素數還會受到探測器的限制，因此探測器的選型需要和系統設計匹配。

圖1. 大視場物鏡雙光子腦成像。(a)成像系統光路圖和物鏡實物圖（左上）；(b) 活體鼠腦神經細胞的雙光子成像，深度為150 μm；(c) (b)中虛線框內的細節放大圖。

圖2. 基于散斑光片照明的大視場成像系統[25]。(a) 系統光路示意圖，激光經ground glass disk形成的散斑圖案投影在體積為4.4×3×3 mm3的樣品內，形成厚度約為3 μm的散斑光片照明；(b) 用光片照明模式實現斑馬魚全身成像；(c)用共聚焦模式實現的斑馬魚全身成像。

圖3. 微透鏡的排列與掃描方向示意

圖4. 陣列顯微系統[39]。(a) 陣列顯微系統光路設置；(b) 小鼠腎臟切片的高通量成像；(c) (b)中紅色框內的放大圖。

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4. 總結 綜上所述，高SBP顯微成像儀的發展路線多樣，在性能上也各自取得了很好的突破。基于透鏡成像的三種系統實現SBP的突破相對更復雜，成本更高，但成像的保真度更高，應用場景更廣；而基于無透鏡計算成像的片上顯微實現SBP的突破更簡單，更直接，對算法和傳感器技術進步的依賴更強，但是其分辨率和成像保真度均有待進一步提升，應用場景相對受限。目前，高SBP顯微成像儀多用于寬場成像，其與相對成熟的各類成像模態（雙光子，超分辨等）、制樣技術（組織光透明，層切，膨脹等）的合理搭配，將會使它的應用場景得到有力的拓展，文中也介紹了一些成功的實踐案例。除了以上提到的四類光學顯微成像技術外，光學相干層析（Optical Coherent Tomography, OCT）、光聲顯微成像等也在大視場成像領域取得了很好的成果，其成像原理雖有差異但實現大視場顯微成像的方法相似——多次掃描與應用高SBP成像物鏡等。目前大視場光學顯微成像技術仍普遍面臨成像幀率這一瓶頸，但隨著傳感器性能和計算機技術的進步，這一問題也必將獲得有效的解決，有望為大視場顯微生物成像提供更好的工具選項。