近日，哈爾濱工業(yè)大學儀器學院青年教授李浩宇團隊在生物醫(yī)學超分辨顯微成像技術(shù)領域取得突破性進展。針對目前超分辨顯微鏡所面臨的成像通量限制，團隊提出基于計算光學成像的新一代高通量三維動態(tài)超分辨率成像方法，通過計算成像技術(shù)增強熒光漲落探測靈敏度，使探測靈敏度提升兩個數(shù)量級以上，突破了現(xiàn)有顯微成像技術(shù)在高通量視場、高空間分辨率和高時間分辨率等難以兼顧的難題，將目前世界上超分辨顯微鏡中最高通量視場成像范圍提升至毫米級，可在10分鐘內(nèi)對包含超過2000個細胞的視場上實現(xiàn)了128納米的超高空間分辨率成像，為細胞學異質(zhì)性和生物醫(yī)學等研究提供新的科學影像儀器。 ?

? 6月15日，該研究成果以《通過增強熒光漲落檢測實現(xiàn)高通量超分辨率成像》（Enhanced detection of fluorescence fluctuations for high-throughput super-resolution imaging）為題，以長文形式在線發(fā)表于國際權(quán)威雜志《自然光子學》（Nature Photonics，2021年影響因子39.7，光學類最高），這是哈工大首次在該刊物上以第一通訊單位發(fā)表論文。

超分辨成像技術(shù)的出現(xiàn)標志著成像領域?qū)τ诠鈱W衍射極限的突破，也極大地推動了生物醫(yī)學領域的發(fā)展。利用超分辨技術(shù)，生物學家得以對病態(tài)細胞內(nèi)的亞細胞結(jié)構(gòu)進行精準的量化統(tǒng)計和直觀的可視化分析。然而，常見的超分辨技術(shù)往往需要復雜的圖像采集設備和特定的成像控制，并且時間分辨率低，成像通量不足，這限制了超分辨成像在生物醫(yī)學中的廣泛應用。

基于熒光漲落物理特性的超分辨成像技術(shù)（Super-resolution optical fluctuation imaging，SOFI）是一種經(jīng)典的基于統(tǒng)計學的超分辨方法，可以在不借助額外光學元件的條件下突破衍射極限。但傳統(tǒng)的SOFI技術(shù)往往需要1000幀以上的原始圖像用于重建，自2009年提出至今仍然難以滿足生物醫(yī)學中對于大視場和細胞器瞬時動態(tài)等研究的高通量成像需求。

為了解決上述問題，李浩宇團隊提出了自相關兩步解卷積超分辨成像（Super resolution imaging based on Auto Correlation with two-step Deconvolution，SACD）。不同于傳統(tǒng)SOFI需要統(tǒng)計大量的原始圖像，SACD通過增強圖像中的可探測熒光漲落特性，在每一幀圖像中提取更多有效信息以實現(xiàn)超分辨成像。SACD在計算超分辨統(tǒng)計量前對原始圖像進行預解卷積，這一獨特的處理增強了熒光信號的開關對比度，更高效地利用信息，從而縮減了重建所需的原始圖像數(shù)量。隨后再將解卷積作為后處理步驟，進一步提升空間分辨率。最終，SACD可以將重建所需原始圖像數(shù)量縮減兩個數(shù)量級以上，并使空間分辨率提升超過兩倍多，滿足了生物醫(yī)學研究的高通量成像需求。

高通量成像——大視場細胞骨架微管成像

研究團隊將SACD方法應用于轉(zhuǎn)盤共焦（Spinning Disk Confocal，SDC）系統(tǒng)，實現(xiàn)了對毫米級（2毫米×1.4毫米）視場內(nèi)微管的高通量超分辨成像，包含多達2000個細胞。傳統(tǒng)SOFI需要幾乎半天的連續(xù)采樣才能對整塊區(qū)域完成重建，而SACD只需10分鐘便可達到更加優(yōu)越的成像性能。在任意區(qū)域中，SACD都保持了極高的分辨率，能夠清晰地分辨鄰近的微管結(jié)構(gòu)，解析出轉(zhuǎn)盤共焦顯微系統(tǒng)無法得到的高頻信息。

活細胞長時程成像——活細胞線粒體外膜動態(tài)成像

為了克服低信噪比與長時程的活細胞成像條件，李浩宇團隊在SACD的基礎上引入了之前開發(fā)的稀疏解卷積技術(shù)（該團隊于去年發(fā)表在《自然生物技術(shù)》期刊上，Weisong Zhao et al.，Nature Biotechnology，40，606–617，2022）。Sparse-SACD使快速而復雜的細胞器動態(tài)過程得以可視化，實現(xiàn)在超過10分鐘的時間內(nèi)對COS-7活細胞線粒體進行快速動態(tài)成像。得益于該技術(shù)的高通量與穩(wěn)定性，線粒體被解析為中空的膜狀細胞器，整個細胞中線粒體的裂變和融合過程都被清晰地記錄下來。

圖為活體四維超分辨成像。轉(zhuǎn)盤共焦顯微鏡（SD-confocal，左）和Sparse-SACD（右）在37°C下對Skylan-S-TOM20標記的活COS-7細胞進行四維成像。比例尺：5微米。 最后，研究者使用SACD技術(shù)進行了全活細胞四維超分辨成像，即在超過10分鐘時間（成像溫度37°C）內(nèi)對COS-7活細胞的線粒體外膜網(wǎng)絡進行三維超分辨體成像（上圖）。與傳統(tǒng)共焦系統(tǒng)相比，精細結(jié)構(gòu)的可見性得到了根本性提高，線粒體被清晰地成像為銳利的中空膜結(jié)構(gòu)。通過稀疏性和連續(xù)性的雙重約束，SACD高保真地實現(xiàn)了隨時間變化的全細胞線粒體裂變與融合成像。

形象地說，分布在熒光背景中的單個分子波動信號就像“迷霧中閃爍的星星”，SACD在計算統(tǒng)計量之前盡可能地消除了這種“迷霧”，以便在真實的生理環(huán)境下實現(xiàn)高質(zhì)量的超分辨成像。通過充分利用原始圖像中的熒光漲落信息，SACD打破了現(xiàn)有超分辨技術(shù)的通量限制以及需要特殊光學控制的設備限制，同時還能夠直接應用于現(xiàn)有商業(yè)化共焦熒光顯微鏡系統(tǒng)（或其他任何熒光系統(tǒng)）中，有助于低成本、高通量地進行相關生物醫(yī)學研究，有望成為生物學家分析細胞結(jié)構(gòu)和瞬態(tài)動力學的常規(guī)儀器。

值得一提的是，SOFI技術(shù)的發(fā)明者、德國喬治-奧古斯都-哥廷根大學教授安德雷恩（J.Enderlein）是該工作的審稿人之一。安德雷恩教授表示：“在漲落分析之前進行預解卷積的想法很新穎，非常合理，因為這應該是消除虛假漲落的好方法”“使用這種技術(shù)呈現(xiàn)的圖像質(zhì)量非常好”“我認為所提出的方法會是更優(yōu)的”。

? 哈工大李浩宇教授和北京大學陳良怡教授為論文的通訊作者；哈工大助理教授趙唯淞為論文的第一作者，論文共同第一作者還包括北京大學趙士群副研究員、哈工大博士研究生韓鎮(zhèn)謙和丁相妍，論文的共同通訊作者還包括哈工大丁旭旻教授和北京大學郭長亮副研究員。哈工大譚久彬院士為論文共同作者和哈工大科研團隊負責人。該項研究成果主要由哈工大儀器學院和北京大學未來技術(shù)學院合作完成，哈工大為論文第一通訊單位。

編輯：黃飛

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