近日，愛思唯爾（Elsevier）旗下著名分析化學(xué)期刊Analytica Chimica Acta（IF：5.977）在線發(fā)表了上海交通大學(xué)系統(tǒng)生物醫(yī)學(xué)研究院陶生策團(tuán)隊(duì)的最新研究成果“Multiplex and Visual Detection of African Swine Fever Virus (ASFV) based on Hive-Chip and Direct Loop-mediated Isothermal Amplification”。該研究基于“蜂巢芯片（Hive-Chip）”和“LAMP直擴(kuò)法”提出了針對(duì)非洲豬瘟病毒多基因并行檢測(cè)的全流程方案，具有無需核酸提取、不依賴精密儀器及避免因病毒的單個(gè)基因突變引起的假陰性問題，且靈敏度高、特異性強(qiáng)、可視化檢測(cè)以及適用于POCT（Point of Care Testing，即時(shí)檢測(cè)/床旁檢測(cè)）等優(yōu)點(diǎn)。本研究也已申請(qǐng)相關(guān)專利“一種靶標(biāo)基因組合在非洲豬瘟病毒檢測(cè)中的應(yīng)用及試劑盒”。

非洲豬瘟 (African swine fever, ASF) 是由非洲豬瘟病毒 (African swine fever virus, ASFV) 引起的豬的一種急性、高度傳染性和致死性的疾病，死亡率高達(dá)100%。截止到2020年3月5日，中國(guó)已有32個(gè)省份共爆發(fā)165起非瘟疫情，累計(jì)撲殺生豬1,193,000頭，給中國(guó)乃至全世界的養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的威脅。ASFV是一種呈二十面體對(duì)稱的dsDNA病毒，基因組巨大（170~190 kb），由于其復(fù)雜的基因組成和高度變異性，已根據(jù)同源性較高的編碼衣殼蛋白VP72的基因B646L被劃分為24個(gè)基因型。目前，ASF尚無有效的治療方式和疫苗，撲殺和焚燒是防止疫情蔓延最有效的手段，因此快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)ASFV至關(guān)重要。

現(xiàn)有ASFV核酸檢測(cè)方法主要存在兩個(gè)問題：只針對(duì)ASFV單基因進(jìn)行檢測(cè)，依賴于復(fù)雜精密的儀器。針對(duì)問題一，本研究首先根據(jù)ASFV序列比對(duì)結(jié)果獲得了較保守的5個(gè)基因（B646L、B962L、C717R、D1133L、G1340L），并針對(duì)每個(gè)基因設(shè)計(jì)4套LAMP（Loop-mediated isothermal amplification，環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增）引物，通過In-tube LAMP和On-Chip LAMP進(jìn)行了有效性（Validity）、特異性（Specificity）和靈敏度（Sensitivity）測(cè)試，得到了一組能夠用于ASFV多基因檢測(cè)的LAMP引物，有效避免因單個(gè)基因突變而造成的假陰性結(jié)果，提高陽性檢出率；針對(duì)問題二，本研究采用物理隔離的策略，將10根毛細(xì)管通過PDMS（聚二甲基硅氧烷）基座集成起來形成酷似蜂窩煤的“蜂巢芯片”，并進(jìn)行疏水修飾。每根毛細(xì)管內(nèi)固定不同基因所對(duì)應(yīng)的LAMP引物，借助加樣接頭（Adaptor）和毛細(xì)現(xiàn)象，使樣本同時(shí)分散到各個(gè)毛細(xì)管內(nèi)，進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增和熒光檢測(cè)，實(shí)現(xiàn)了一次反應(yīng)同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，并且LAMP直擴(kuò)法免去了核酸提取步驟。

基于此，團(tuán)隊(duì)成員分別對(duì)豬血模擬樣本和ASFV基因組DNA樣本成功進(jìn)行了檢測(cè)，并以其他豬病毒基因組DNA樣本（包括豬偽狂犬病病毒PRV、豬圓環(huán)病毒2型PCV2以及豬細(xì)小病毒PPV）進(jìn)行了特異性檢測(cè)。為了進(jìn)一步證明ASFV多基因檢測(cè)的必要性，團(tuán)隊(duì)成員將現(xiàn)有ASFV菌株（GenBank: EF121429.1, MH025920.1, KM111295.1，MH025919.1）存在的點(diǎn)突變引入B646L基因質(zhì)粒中，芯片檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)（即1號(hào)毛細(xì)管）呈陰性，而其他毛細(xì)管呈陽性，表明如果此時(shí)只檢測(cè)B646L基因，就會(huì)出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

綜上，本研究針對(duì)ASFV開發(fā)了通用的多重核酸檢測(cè)平臺(tái)，特別是針對(duì)易變的病原體（例如新冠病毒），通過一次反應(yīng)檢測(cè)多個(gè)基因，既能實(shí)現(xiàn)多重可視化檢測(cè)，又不依賴精密儀器和專業(yè)操作，適合口岸檢驗(yàn)檢疫和現(xiàn)場(chǎng)即時(shí)檢測(cè)。

本研究的第一作者為上海交通大學(xué)2017級(jí)博士研究生朱元首，通訊作者為上海交通大學(xué)陶生策研究員和北京博奧生物張巖博士。

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