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單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究新突破!將微流控液滴與蛋白質(zhì)組分析技術(shù)相結(jié)合

MEMS ? 來源:未知 ? 作者:工程師曾玲 ? 2018-07-19 10:17 ? 次閱讀

近日,浙江大學(xué)方群團(tuán)隊(duì)聯(lián)合北京大學(xué)黃超蘭團(tuán)隊(duì)在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究領(lǐng)域取得了突破性進(jìn)展。此項(xiàng)成果近日以全文形式在線發(fā)表于美國化學(xué)會(huì)的Analytical Chemistry雜志上(影響因子6.32),論文題目為“Nanoliter-Scale Oil-Air-Droplet Chip-Based Single Cell Proteomic Analysis”。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究新突破!將微流控液滴與蛋白質(zhì)組分析技術(shù)相結(jié)合

圖:納升級油-氣-液滴(OAD)芯片和自動(dòng)定位(SAM)裝置的結(jié)構(gòu)示意圖(a)和用于單細(xì)胞蛋白質(zhì)組分析的樣品前處理和上樣的全流程圖(b)。

蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組計(jì)劃之一,也是近年來的熱點(diǎn)研究領(lǐng)域。作為生命體內(nèi)功能直接執(zhí)行者的蛋白質(zhì),和基因相比在揭示生命發(fā)育和疾病的發(fā)生發(fā)展的機(jī)制方面有更重大的意義。近年來,基于細(xì)胞群體內(nèi)的蛋白質(zhì)組學(xué)研究,因?yàn)椴豢杀苊獾貢?huì)將大量細(xì)胞內(nèi)的信息平均化,已經(jīng)越來越難以滿足對生命功能更加深入探究的需要。從單細(xì)胞層面去了解細(xì)胞特征以及彼此之間的相互影響,可以為生物系統(tǒng)中細(xì)胞間的異質(zhì)性提供更寶貴的信息,因此有著越來越大的迫切需求。鑒于蛋白質(zhì)不具有直接擴(kuò)增的特性,以及蛋白質(zhì)組學(xué)分析靈敏度的限制,目前對于少量乃至單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的檢測在技術(shù)上還是極具挑戰(zhàn)的。

單細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)含量極少,就典型體細(xì)胞而言僅為0.1- 0.2 ng,遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于常規(guī)蛋白質(zhì)組學(xué)樣品前處理所需要的微克級蛋白量。并且細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)通常需要在離心管內(nèi)完成復(fù)雜多步的前處理操作,包括細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)釋放、蛋白質(zhì)沉淀純化、蛋白質(zhì)還原和烷基化、酶切等,一個(gè)全細(xì)胞裂解蛋白質(zhì)組的最后反應(yīng)體積均是幾十甚至過百微升,在這個(gè)蛋白質(zhì)組學(xué)常規(guī)前處理的過程中,由于樣品與離心管的接觸、多步的樣品轉(zhuǎn)移和不完全上樣等原因,在進(jìn)入質(zhì)譜之前不可避免地帶來了蛋白質(zhì)的損失。用此流程來處理單細(xì)胞,即使之后結(jié)合液相色譜儀器的自動(dòng)進(jìn)樣閥可以以小于十微升的體積完成上樣也無濟(jì)于事,因?yàn)樯形吹鹊椒蛛x蛋白質(zhì)樣品就有可能已經(jīng)損失大半了。

單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究新突破!將微流控液滴與蛋白質(zhì)組分析技術(shù)相結(jié)合

如果說單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)是在米粒上雕刻,那么兩個(gè)團(tuán)隊(duì)就是造出了適合在米粒上雕刻的工具刀。該項(xiàng)研究起自2014年,兩個(gè)團(tuán)隊(duì)的研究人員協(xié)同合作將微流控液滴技術(shù)與蛋白質(zhì)組分析技術(shù)相結(jié)合,發(fā)展了一種微型化的油-氣-液“三明治”芯片及相應(yīng)的納升級液體操控和進(jìn)樣方法,能夠在原位靜態(tài)的納升級液滴中完成少量細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析所必需的多步樣品前處理操作,并且實(shí)現(xiàn)了將液滴樣品直接高效地注入到色譜分析柱內(nèi)完成后續(xù)的液相色譜分離與質(zhì)譜檢測。通過采用優(yōu)化后的芯片材料、裂解試劑、酶切比例和色譜質(zhì)譜參數(shù)等實(shí)驗(yàn)條件,該芯片系統(tǒng)可以分別成功地從100、50、10和1個(gè)HeLa細(xì)胞內(nèi)鑒定到1360、612、192和51個(gè)蛋白質(zhì)。更重要的是,研究人員首次實(shí)現(xiàn)了以單個(gè)鼠卵母細(xì)胞為初始樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析,一共鑒定到355種蛋白質(zhì),其中存在一系列與生殖發(fā)育(Ovgp1和Pabpc1)、疾病相關(guān)(AnxA6,Kpna2,Cct6a和Pcbp2)的基因。在該工作中,還采用兩種常規(guī)的基于離心管的前處理方法進(jìn)行了對照實(shí)驗(yàn),實(shí)驗(yàn)結(jié)果明確證實(shí)了微流控液滴體系具有更低的樣品吸附損失、更高的酶切效率和更高效的疏水性蛋白質(zhì)鑒定能力等明顯優(yōu)勢,更適用于微量蛋白質(zhì)樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

此項(xiàng)研究帶來三個(gè)突破:首先是成功發(fā)展了適合進(jìn)行單細(xì)胞及類似微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析樣品前處理芯片和方法。芯片內(nèi)550 納升的液滴與芯片的接觸面積僅為常規(guī)離心管模式下的十五分之一,顯著減少了樣品與反應(yīng)器接觸所帶來的損失;二是發(fā)展了一種實(shí)現(xiàn)納升級液滴的直接進(jìn)樣方法,利用3D打印加工的自動(dòng)定位裝置和高壓氣泵高效地(> 99%)將液滴樣品注入到分析色譜柱內(nèi),完全避免了樣品轉(zhuǎn)移和經(jīng)過液相儀器內(nèi)復(fù)雜管路帶來的損失;第三是為避免在常規(guī)微流控液滴系統(tǒng)中由于油相直接接觸液滴而造成的缺陷,提出了一種采用氣相來間隔液滴相和油相的新型液滴芯片結(jié)構(gòu),在成功防止液滴明顯蒸發(fā)的同時(shí),還避免了油相和液滴相直接接觸帶來的脂溶性樣品的損失,也使系統(tǒng)能更方便地進(jìn)行后續(xù)的分離柱進(jìn)樣、色譜分離和質(zhì)譜檢測。

該項(xiàng)研究在基于質(zhì)譜的單細(xì)胞及微量樣品的蛋白質(zhì)組學(xué)分析方面開啟了全新的技術(shù),其所具有的系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單、容易搭建、操作方便、可靠性高等特點(diǎn),使其有望被廣泛應(yīng)用到細(xì)胞間異質(zhì)性的研究以及與臨床相關(guān)的研究,包括稀有的循環(huán)腫瘤細(xì)胞分析、生殖細(xì)胞相關(guān)研究和疾病診療等方面,因此在未來具有巨大的持續(xù)開發(fā)和應(yīng)用轉(zhuǎn)化前景。

(左上:浙江大學(xué)教授方群、右上:北京大學(xué)教授黃超蘭、左下:浙江大學(xué)博士生李紫藝、右下:前國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·上海高級工程師黃敏)

該論文的第一作者為浙江大學(xué)博士生李紫藝,通訊作者為浙江大學(xué)化學(xué)系微分析系統(tǒng)研究所方群教授和北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部精準(zhǔn)醫(yī)療多組學(xué)研究中心主任黃超蘭教授。工作得到了國家自然科學(xué)基金和中國科學(xué)院杰出技術(shù)人才項(xiàng)目的支持。黃超蘭教授的部分工作在前單位中科院國家蛋白質(zhì)科學(xué)中心·上海完成,特此鳴謝!

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原文標(biāo)題:“雕刻”細(xì)胞!浙大、北大聯(lián)手在單細(xì)胞蛋白質(zhì)組學(xué)分析研究領(lǐng)域取得新突破!

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