近期，中國(guó)科學(xué)院廣州健康院張驍研究員團(tuán)隊(duì)提出一種基于結(jié)構(gòu)微流體創(chuàng)新的譜系細(xì)胞單克隆自動(dòng)化獲取策略，以無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式，在體細(xì)胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定譜系的單克隆性細(xì)胞的自動(dòng)化獲取，并研發(fā)出基于結(jié)構(gòu)微流體的細(xì)胞單克隆獲取整機(jī)技術(shù)（圖1）。

圖1 自動(dòng)化譜系細(xì)胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機(jī)技術(shù)概要

該原創(chuàng)性策略被部署于廣州健康院前期自主研發(fā)的自動(dòng)化干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)裝備，提高了人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（hiPSCs）單克隆的獲取效率與純度，提升了系統(tǒng)魯棒性（robustness）及縮短了體細(xì)胞重編程后持續(xù)純化hiPSCs（sub-cloning）的建系周期。相關(guān)研究成果以“Selecting Monoclonal Cell Lineages from Somatic Reprogramming Using Robotic-Based Spatial-Restricting Structured Flow”為題發(fā)表在Research期刊上。

盡管譜系節(jié)點(diǎn)細(xì)胞在再生醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用前景廣闊，但基于傳統(tǒng)人為操作獲取譜系細(xì)胞單克隆的方法需要消耗大量時(shí)間和勞動(dòng)力，獲取效率通常比較低，且無(wú)法以無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式獲取譜系細(xì)胞單克隆。此外，利用微流控技術(shù)雖然可以提高譜系細(xì)胞收獲效率，但這種方法無(wú)法獲得基于譜系特異性的細(xì)胞單克隆。因此，發(fā)展能夠高效富集譜系細(xì)胞單克隆的自動(dòng)化整機(jī)技術(shù)顯得尤為重要。

細(xì)胞-細(xì)胞/細(xì)胞-基質(zhì)之間的粘附力變化是譜系細(xì)胞命運(yùn)變化中的一個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié)，通過調(diào)節(jié)流體剪切力大小可以實(shí)現(xiàn)以無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶活反應(yīng)參與、非侵入式的方式分離/選擇具有不同粘附特性的譜系細(xì)胞單克隆，這種策略可以應(yīng)用于基于細(xì)胞類型特異性的單克隆工程化獲取。張驍研究員團(tuán)隊(duì)前期研究中利用AI算法實(shí)現(xiàn)了對(duì)重編程細(xì)胞單克隆的識(shí)別和預(yù)測(cè)，并將AI技術(shù)應(yīng)用于生命科學(xué)儀器整機(jī)技術(shù)研究。該團(tuán)隊(duì)在前期依托中國(guó)科學(xué)院廣州健康院研發(fā)出了具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的自動(dòng)化干細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)設(shè)備，憑借這些研究背景，結(jié)合整機(jī)技術(shù)和分子組織生物學(xué)認(rèn)知以及空間結(jié)構(gòu)微流體操控技術(shù)，該團(tuán)隊(duì)研發(fā)了自動(dòng)化整機(jī)，通過以編程的方式精確操控結(jié)構(gòu)微流體，并產(chǎn)生具有空間定位的流體剪切力，實(shí)現(xiàn)在復(fù)雜高異質(zhì)性的細(xì)胞環(huán)境中通過流體變化選擇特定的細(xì)胞類型，并實(shí)現(xiàn)譜系細(xì)胞單克隆的特異性獲取。

通過分析不同體細(xì)胞重編程過程中細(xì)胞粘附分子的表達(dá)水平變化情況，研究人員發(fā)現(xiàn)細(xì)胞多能性基因的表達(dá)水平與Integrin家族基因的表達(dá)量呈負(fù)相關(guān)性，而與Cadherin家族基因的表達(dá)量呈正相關(guān)性。由于Integrins是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）相互作用的關(guān)鍵粘附分子，而Cadherins是細(xì)胞與細(xì)胞之間相互連接的重要分子，這意味著體細(xì)胞重編程轉(zhuǎn)變成多能干細(xì)胞這一譜系命運(yùn)變化過程中，細(xì)胞與ECM的連接可能會(huì)減弱，而細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接可能會(huì)增強(qiáng)。為了證明這個(gè)假設(shè)，張驍研究員提出進(jìn)一步通過設(shè)計(jì)平行平板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)和免疫熒光實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與預(yù)期假設(shè)相一致，并且平行平板流動(dòng)腔實(shí)驗(yàn)初步證明了流體剪切力有望成為分離/選擇特定類型粘附細(xì)胞的好技術(shù)路徑（圖2）。

圖2體細(xì)胞重編程中細(xì)胞譜系命運(yùn)變化伴隨著粘附分子表達(dá)的改變，流體剪應(yīng)力可用于分離粘附細(xì)胞

隨后，論文第一作者陳學(xué)平博士基于流體動(dòng)力學(xué)原理設(shè)計(jì)了可以產(chǎn)生局部結(jié)構(gòu)微流體的細(xì)胞獲取微型挑針結(jié)構(gòu)（PTMS），團(tuán)隊(duì)克服了流場(chǎng)效果與多曲面加工實(shí)現(xiàn)的難題，反復(fù)校驗(yàn)加工結(jié)構(gòu)，最終基于PTMS產(chǎn)生的結(jié)構(gòu)微流體（PTMS-FLOW）實(shí)現(xiàn)了對(duì)基于空間限位譜系細(xì)胞的特異性挑取。此外，研究證明了PTMS-FLOW可根據(jù)流速變化在Z軸-h0的為常量的條件下，應(yīng)對(duì)不同細(xì)胞類型的粘附力差異，實(shí)現(xiàn)以無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶活反應(yīng)參與、非侵入式、和非接觸的方式對(duì)不同譜系細(xì)胞進(jìn)行特異性的選擇。該研究證明了結(jié)構(gòu)微流體是作為分離/選擇特定譜系類型粘附細(xì)胞的可自動(dòng)化的技術(shù)路徑，為后續(xù)進(jìn)一步研究譜系細(xì)胞單克隆的自動(dòng)化獲取提供了理論基礎(chǔ)（圖3）。

圖3 基于空間定位的結(jié)構(gòu)微流體研究不同譜系細(xì)胞的粘附分離作用

為了將上述策略應(yīng)用于對(duì)體細(xì)胞重編程過程中特定譜系的細(xì)胞的自動(dòng)化獲取，研究團(tuán)隊(duì)通過克服機(jī)械模塊控制和精準(zhǔn)調(diào)度的難題，結(jié)合細(xì)胞光學(xué)成像和自適應(yīng)算法，實(shí)現(xiàn)精準(zhǔn)操控微結(jié)構(gòu)的功能底部與細(xì)胞單克隆之間的Z軸間距和水平位移，從而確保精準(zhǔn)操控PTMS-FLOW作用于單克隆性的譜系細(xì)胞上，以此實(shí)現(xiàn)在體細(xì)胞重編程過程出現(xiàn)的復(fù)雜譜系中快速獲取hiPSCs細(xì)胞單克隆的目標(biāo)（圖4）。

圖4 研發(fā)自動(dòng)化譜系細(xì)胞培養(yǎng)/及單克隆獲取整機(jī)技術(shù)

此外，研究團(tuán)隊(duì)借助自動(dòng)化整機(jī)技術(shù)的精確的流體操控能力，設(shè)計(jì)了一種雙挑模式（Dual Run Selection），通過使用兩次不同強(qiáng)度的剪切流體分別獲取不同類型粘附特性的譜系細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)了對(duì)特定空間位置的hiPSCs譜系細(xì)胞單克隆的特異性選擇（圖5），并能為下游hiPSCs實(shí)現(xiàn)特異性擴(kuò)增提供純化（sub-cloning）能力。

圖5 基于譜系細(xì)胞粘附力的差異，應(yīng)用PTMS-FLOW實(shí)現(xiàn)了對(duì)重編程多能干細(xì)胞單克隆的選擇

綜上所述，研究團(tuán)隊(duì)提出一種基于微型挑針結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的PTMS-FLOW實(shí)現(xiàn)了以無(wú)標(biāo)記、無(wú)酶活反應(yīng)參與、和非侵入式的方式快速獲取譜系細(xì)胞單克隆的目標(biāo)，并研發(fā)出具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的譜系細(xì)胞單克隆自動(dòng)化獲取的整機(jī)技術(shù)。該整機(jī)技術(shù)通過大幅減少譜系細(xì)胞生成過程中的時(shí)間成本，以及人工操作量，使得譜系細(xì)胞獲取和培養(yǎng)起來更簡(jiǎn)單。該研究為自動(dòng)化生產(chǎn)特定譜系細(xì)胞用于臨床干預(yù)提供了新的技術(shù)方案，并為再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)研究提供更多自動(dòng)化獲取譜系細(xì)胞的工具，從而從技術(shù)手段和方法學(xué)方面促進(jìn)再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用落地。

論文鏈接：

https://doi.org/10.34133/research.0338