對于外周神經(jīng)缺損，尤其是較大外周神經(jīng)缺損，由于其再生能力有限，臨床實踐中患者恢復效果較差。近日，來自蘭州大學的范增杰教授團隊利用自供電微針貼片制成的可植入神經(jīng)引導導管，進行了坐骨神經(jīng)修復的相關(guān)研究。研究成果以“Implantable Nerve Conduit Made of a Self-Powered Microneedle Patch for Sciatic Nerve Repair”為題于發(fā)表在AHM期刊上。

該研究設(shè)計并制造了一種先進的自供電酶聯(lián)微針（MN）神經(jīng)引導導管（NGCs）。這種創(chuàng)新型導管由陽極和陰極微針陣列組成，其中分別含有封裝在ZIF-8納米顆粒中的葡萄糖氧化酶（Gox）和辣根過氧化物酶（HRP）。通過級聯(lián)反應(yīng)，基于微針的神經(jīng)引導導管產(chǎn)生微電流，刺激坐骨神經(jīng)支配的肌肉、血管和神經(jīng)纖維再生，最終加速坐骨神經(jīng)損傷的修復。該自供電微針神經(jīng)引導導管將徹底改變坐骨神經(jīng)損傷的傳統(tǒng)治療方法，并在神經(jīng)組織修復領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

圖1 促進坐骨神經(jīng)修復的自供電級聯(lián)微針神經(jīng)引導導管示意圖

該研究利用聚多巴胺（DA）修飾的聚吡咯（PPy）/聚乙烯醇（PVA）（DPP）水凝膠組成導電基底，開發(fā)了一種自供電和自組裝的微針神經(jīng)引導導管（MNGCs）。這些微針神經(jīng)引導導管一半裝有含葡萄糖氧化酶（Gox）的ZIF-8，一半裝有含辣根過氧化物酶（HRP）的ZIF-8，分別形成陽極和陰極微針陣列。兩個陣列之間的酶聯(lián)作用通過消耗血糖產(chǎn)生微電流，促進損傷坐骨神經(jīng)的修復，恢復坐骨神經(jīng)損傷大鼠的運動和感覺。結(jié)果表明，DPP導電基底具有良好導電性，能將酶聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生的電子介導出來，形成完整電流通路。微針神經(jīng)引導導管具有高柔韌性，其微米大小的尖端可插入神經(jīng)殘端周圍組織，固定神經(jīng)并防止在運動過程中發(fā)生移位。此外，微針神經(jīng)引導導管不僅能為神經(jīng)修復提供物理支持，引導軸突生長，還能通過自身微電流調(diào)節(jié)細胞，引導神經(jīng)元再生，達到周圍神經(jīng)損傷治療效果。

DA-PPy、ZIF-8和ZG/ZH納米粒子表征

研究人員為了克服PPy在水中分散性差的問題，使用DA改性以改善PPy在水中的分散性。利用掃描電子顯微鏡（SEM）觀察所制備的DA-PPy復合材料表面形態(tài)，發(fā)現(xiàn)經(jīng)DA改性后，PPy的形態(tài)發(fā)生轉(zhuǎn)變，從成團的團塊變成均勻的短纖維（圖2a）。傅立葉變換紅外光譜（FTIR）分析進一步證實DA-PPy成功合成，在DA-PPy復合材料中觀察到DA的特征帶出現(xiàn)在2930/cm處。接著使用透射電鏡（TEM）對合成的ZIF-8和負載Gox以及HRP的ZIF-8納米粒子的形態(tài)進行表征。可以看出ZIF-8具有菱形十二面體的幾何形狀，尺寸分布均勻。然而，由于添加了Gox和HRP，ZIF-8納米晶體結(jié)構(gòu)變成表面粗糙的球形顆粒。該研究采用兩步法制備用于神經(jīng)修復的自供電微針神經(jīng)引導導管，微針貼片由11 ×11的有序錐形針陣列組成，整齊排列在微針基質(zhì)上。微針神經(jīng)引導導管兩部分中的ZG和ZH納米粒子可感知局部體液中的血糖，并迅速促進酶級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生，從而產(chǎn)生微電流。微針神經(jīng)引導導管陽極陣列中的ZG納米顆粒所含的Gox與體液中的血糖迅速反應(yīng)，生成葡萄糖酸和過氧化氫。含有HRP的陰極微針陣列會與生成的過氧化氫進一步反應(yīng)，生成氧和水，釋放出陽極陣列中的電子，使電子流形成回路，最終產(chǎn)生微電流。這些微電流可能有利于周圍神經(jīng)損傷的快速修復。

圖2 材料表面和微針形態(tài)分析

細胞生物相容性和遷移

通過活死細胞染色評估微針貼片的生物相容性。結(jié)果表明，在整個培養(yǎng)過程中，與不同微針貼片共培養(yǎng)的膠質(zhì)瘤細胞大部分都是綠色熒光而非紅色熒光染色，表明具有導電性的微針貼片具有良好的生物相容性。使用MTT法檢測了微針貼片對膠質(zhì)瘤細胞的毒性作用，結(jié)果表明，在整個培養(yǎng)過程中，與不同微針貼片共培養(yǎng)的細胞存活率均超過80%，進一步驗證了微針貼片對細胞無毒性作用。接著利用劃痕實驗研究制備的微針貼片對細胞遷移的影響。與對照組和其他實驗組相比，自供電ZGH-MN組向劃痕中心區(qū)域的線性遷移距離更長，說明微針神經(jīng)引導導管產(chǎn)生的生理電流能促進細胞遷移，加快損傷坐骨神經(jīng)的修復。這些結(jié)果證明了微針神經(jīng)引導導管在神經(jīng)修復應(yīng)用中的潛力。

圖3 微針貼片的生物相容性和劃痕實驗

組織學評估

為評估不同組的神經(jīng)再生效果，在術(shù)后6周和12周對大鼠的坐骨神經(jīng)進行H&E染色。第6周時，與其他組相比，Blank-MN組和ZIF-MN組的再生神經(jīng)組織結(jié)構(gòu)稀疏，而ZGH-MN組和自體移植組的修復效果最好。第12周時，愈合組織具有更多的新生神經(jīng)組織，尤其是在ZGH-MN組，再生神經(jīng)纖維和細胞明顯增多，僅次于自體移植組。各組再生神經(jīng)組織之間也都出現(xiàn)新生血管。

圖4 第6周和第12周H&E染色圖像

免疫熒光染色評估

雪旺細胞（SCs）是周圍神經(jīng)的初級細胞之一，其外表面有一層基底膜，可分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進受損神經(jīng)元生存及其軸突再生。使用NF200（神經(jīng)絲）和S-100（雪旺細胞）免疫熒光分析來評估再生神經(jīng)中軸突和SC的生長情況。所有組都有新軸突生長和由SC組成的髓鞘形成。自體移植組兩種標記的陽性面積比例最高。在微針處理組中，ZGH-MN組兩種標記物的表達水平明顯高于其他實驗組，表明自供電微針神經(jīng)引導導管可通過促進SCs生長和髓鞘形成來促進軸突再生。總之，自供電酶聯(lián)微針神經(jīng)引導導管在促進軸突再生、髓鞘化以及肌肉和神經(jīng)再生方面具有顯著功效。微針神經(jīng)引導導管機械特性強同時自粘附特性，可防止神經(jīng)導管脫落，避免手術(shù)縫合造成二次神經(jīng)損傷。陽極微針陣列中ZG和陰極微針陣列中ZH之間的氧化還原反應(yīng)可與體液中反應(yīng)形成生理微電流。微針神經(jīng)引導導管的良好導電性和生物可塑性也有助于提高其有效性。最后，微針神經(jīng)引導導管產(chǎn)生的生理微電流刺激可激活和鍛煉肌肉纖維，防止神經(jīng)損傷后發(fā)生萎縮。

圖5 神經(jīng)元再生和SCs生長情況

綜上所述，該研究通過將微針與酶級聯(lián)反應(yīng)相結(jié)合，成功開發(fā)出一種新型自供電級聯(lián)微針神經(jīng)引導導管。研究人員對微針神經(jīng)引導導管形態(tài)、導電性、機械性能和生物兼容性進行全面評估。結(jié)果表明，微針針尖保持完整形狀，可以將微針神經(jīng)引導導管固定在損傷神經(jīng)末端。均勻分布在針尖上的ZG和ZH納米顆粒與體液接觸后，通過酶級聯(lián)反應(yīng)產(chǎn)生電生理信號，促進神經(jīng)修復。總之，自供電酶級聯(lián)微針神經(jīng)引導導管具有產(chǎn)生電生理信號同時促進軸突再生、髓鞘化、肌肉和神經(jīng)生長的能力。自供電酶級聯(lián)微針神經(jīng)引導導管可以作為神經(jīng)修復領(lǐng)域一種有前途的解決方案。

審核編輯：劉清