單顆粒低溫電子顯微鏡（cryo-EM）可以重建不同構(gòu)象蛋白質(zhì)的高分辨率結(jié)構(gòu)。蛋白質(zhì)的功能通常涉及瞬時(shí)功能構(gòu)象，這可以通過時(shí)間分辨冷凍電子顯微鏡（TrEM）來解析。在TrEM中，蛋白質(zhì)溶液在電磁柵格上快速玻璃化，經(jīng)過規(guī)定的延遲時(shí)間后反應(yīng)停止。盡管冷凍電鏡界對TrEM的興趣與日俱增，但制作時(shí)間分辨率低于100毫秒的TrEM樣品仍具有挑戰(zhàn)性。

近期，來自比利時(shí)佛朗德生物技術(shù)研究院的Rouslan G. Efremov團(tuán)隊(duì)報(bào)告了一種時(shí)間分辨冷凍柱塞的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)，該柱塞將基于液滴的微流控混合器與激光誘導(dǎo)的微射流發(fā)生器結(jié)合在一起，可快速啟動(dòng)反應(yīng)并冷凍電磁柵。對GroEL:GroES合子蛋白復(fù)合物進(jìn)行的TrEM實(shí)驗(yàn)解析了復(fù)合物形成的動(dòng)力學(xué)過程，并觀察到了GroEL-ATP復(fù)合物的假定的短壽命構(gòu)象。相關(guān)工作以“Time-resolved cryo-EM using a combination of droplet microfluidics with on-demand jetting”為題發(fā)表在國際頂級期刊Nature Methods上。

在微流控芯片中（圖1），兩種水溶液在油相中混合并封裝成體積約為100 pL的微液滴。液滴中的成分通過混沌平流進(jìn)行混合，在液滴通過纏繞通道時(shí)，混沌平流得到加強(qiáng)。該研究發(fā)現(xiàn)，在由三圈組成的蛇形通道中，混合效率超過50%。在液滴合并產(chǎn)生噴霧時(shí)，混合在芯片下游完成。為了最大限度地減少噴灑在電磁柵上的油量，使用柱狀液滴合并模塊將水相液滴合并成連續(xù)流，從而將水相和油相分離到不同的通道中。混合水溶液被導(dǎo)入噴嘴，通過激光誘導(dǎo)空化（LIC）產(chǎn)生氣懸液滴。聚焦在噴嘴旁微流控通道上的脈沖激光被溶解在水相中的染料吸收，產(chǎn)生大量壽命為微秒的氣泡。氣泡的膨脹和崩潰導(dǎo)致半月板快速擺動(dòng)和液體噴射。LIC具有局部驅(qū)動(dòng)的優(yōu)勢：在保持微流控芯片設(shè)計(jì)簡潔性的同時(shí)，可通過改變激光功率和頻率對過程進(jìn)行調(diào)諧。該研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用濃度高于8 mM的莧菜染料時(shí)，脈沖Q 開關(guān)Nd:YAG 激光器（WL 532 nm，6 ns）在每個(gè)脈沖和每個(gè)焦點(diǎn)的激光功率為4 μJ~ 10 μJ時(shí)可產(chǎn)生穩(wěn)定的噴霧。生成液滴的速度在3至6 m/s之間。

圖1 時(shí)間分辨柱塞的設(shè)計(jì)及特性

在EM網(wǎng)格圖譜上觀察到的液滴數(shù)量與預(yù)期的噴射微射流數(shù)量一致（圖 2），并且隨著柱塞時(shí)間的增加而增加，因?yàn)榫W(wǎng)格在噴嘴前停留的時(shí)間更長（圖1e）。該研究對22個(gè)驟降網(wǎng)格的分析表明，約65%被噴霧潤濕的網(wǎng)格方格的冰區(qū)對電子部分透明，允許電子束穿透冰層厚度而不被完全衰減，30%被潤濕的方格的區(qū)域可用于低溫電子顯微鏡數(shù)據(jù)采集。該研究觀察到，液滴在等離子體清洗過的碳孔網(wǎng)表面迅速擴(kuò)散，但許多孔仍然是空的。該研究認(rèn)為這種效應(yīng)是由于液滴在孔上擴(kuò)散時(shí)產(chǎn)生了額外的表面能量，而使用支撐膜可以減輕這種效應(yīng)。在測試了幾種支撐膜后，發(fā)現(xiàn)剛經(jīng)過等離子體清洗的柵格上多了一層2 ~ 3納米厚的碳膜，從而改善了液滴的擴(kuò)散，并將適合冷凍電鏡數(shù)據(jù)采集的孔的數(shù)量增加了2 ~ 3倍。冰的厚度小于100 nm的區(qū)域出現(xiàn)在柱塞時(shí)間在3到200毫秒之間的網(wǎng)格上。每個(gè)網(wǎng)格收集了幾百到幾千張高對比圖像。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，從兩個(gè)EM網(wǎng)格收集低溫電子顯微鏡數(shù)據(jù)，并重建阿樸鐵蛋白和β-半乳糖苷酶的三維（3D）圖，其分辨率在2.1至3.3 ?之間。

圖2 時(shí)間分辨低溫柱塞的基準(zhǔn)

在分辨率介于2.2和7.1 ?之間的情況下，該研究共進(jìn)行了15次重建（圖3和 4），其中包括6種物質(zhì)。在其中的三種復(fù)合物（GroEL-ATP、GroEL-ATP- GroES和GroEL-ATP-2GroES）中，結(jié)合核苷酸的磷酸化狀態(tài)得到了明確的解析。在其它三種復(fù)合物，即GroEL-(ADP)、GroEL-(ATP)/(ADP)和GroEL-ATP/(ADP)-GroES中，GroEL七聚環(huán)的構(gòu)象與ATP和/或ADP結(jié)合的狀態(tài)相對應(yīng)；然而，由于分辨率有限，結(jié)合核苷酸的磷酸化狀態(tài)不明確。所有時(shí)間點(diǎn)的數(shù)據(jù)質(zhì)量都很高，不僅能進(jìn)行高分辨率重建，還能進(jìn)行三維分類，并分離出僅含4%顆粒的小群體。有趣的是，由于在50毫秒和200毫秒時(shí)，GroEL-ATP復(fù)合物所占的顆粒比例高于20秒時(shí)，因此從時(shí)間分辨數(shù)據(jù)中獲得的重建分辨率（2.7和2.3 ?）高于從連續(xù)周轉(zhuǎn)數(shù)據(jù)中獲得的分辨率（2.8 ?）。TrEM重建顯示了構(gòu)象格局是如何隨著反應(yīng)的進(jìn)行而發(fā)生變化的（圖3）。在短反應(yīng)時(shí)間（13毫秒和50毫秒）內(nèi)，GroEL-ATP 復(fù)合物是主要形式，但GroEL-(ADP)和GroEL-(ATP)/(ADP)復(fù)合物也被解析出來，這些可能代表在形成GroEL-ATP構(gòu)象過程中的短暫狀態(tài)。盡管這些重構(gòu)的分辨率有待提高，以明確解析結(jié)合核苷酸的磷酸化狀態(tài)，但它們清楚地解析了GroEL七聚環(huán)的類ATP和類ADP構(gòu)象，核苷酸結(jié)合袋含有與結(jié)合核苷酸一致的密度（圖4b）。

圖3 根據(jù)時(shí)間分辨和穩(wěn)態(tài)數(shù)據(jù)對GroEL-GroES復(fù)合物進(jìn)行三維重建

在該研究中，與GroEL結(jié)合的核苷酸密度在所有重構(gòu)中都得到了明確的解析。更具體地說，在13毫秒時(shí)間點(diǎn)的GroEL-ATP狀態(tài)下，ATP分子的構(gòu)象（包括一個(gè)腺嘌呤環(huán)、三個(gè)磷酸基團(tuán)以及配位的Mg2?和K?）得到了很好的解析，而從50毫秒開始，該研究在分辨率介于2.3和2.8 ?之間時(shí)獲得的重構(gòu)也解析了ATP結(jié)合口袋中的水分子（圖4a）。這些結(jié)果凸顯了該方法在毫秒級時(shí)間尺度上研究小分子與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)用性。有了反應(yīng)時(shí)間范圍內(nèi)的構(gòu)象分布，就可以分析GroEL-GroES復(fù)合物形成的動(dòng)力學(xué)（圖 4c）。GroEL-GroES和GroEL-2GroES復(fù)合物的比例分別從50毫秒時(shí)的5%和0%增加到20秒時(shí)的約24%和65%。組裝始于GroEL-GroES復(fù)合物的形成，隨后加入第二個(gè)GroES七聚體。在200毫秒到20秒之間，復(fù)合物的比例出現(xiàn)大幅增加，這與FRET實(shí)驗(yàn)估計(jì)的GroEL-GroES復(fù)合物形成的預(yù)期速率一致，即在亞秒級范圍內(nèi)。該研究還通過將GroEL與ATP和GroES混合收集了13毫秒的數(shù)據(jù)，結(jié)果證實(shí)在這一較短的反應(yīng)時(shí)間點(diǎn)，GroEL-GroES 復(fù)合物的比例較低（約為5%）。

圖4 TrEM GroEL–GroES重建的詳細(xì)信息

綜上所述，該研究介紹了一種用于制備時(shí)間分辨冷凍電鏡網(wǎng)格的儀器的設(shè)計(jì)、實(shí)現(xiàn)和驗(yàn)證。它建立在皮升液滴微流控混合器和LIC按需生成可調(diào)微射流的優(yōu)勢之上。這種方法解決了其他用于時(shí)間分辨冷凍電鏡的樣品制備方法的局限性，減少了樣品消耗，提高了制備的冷凍電鏡網(wǎng)格的可重復(fù)性，同時(shí)保持了較高的時(shí)間和空間分辨率。

審核編輯：彭菁