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UL-1000超微量可見分光光度計測定RNA質量檢測應用方案

macylab ? 來源:macylab ? 作者:macylab ? 2022-11-08 09:55 ? 次閱讀

簡介

核糖核酸(縮寫為RNA,即RibonucleicAcid),存在于生物細胞以及部分病毒、類病毒中的遺傳信息載體。RNA由核糖核苷酸經磷酸二酯鍵縮合而成長鏈狀分子。一個核糖核苷酸分子由磷酸,核糖和堿基構成。RNA的堿基主要有4種,即A腺嘌呤、G鳥嘌呤、C胞嘧啶、U尿嘧啶,其中,U(尿嘧啶)取代了DNA中的T。

原理細胞中的RNA可以分為信使RNA、轉運RNA和核糖體RNA三大類,不同組織總RNA提取的實質就是將細胞裂解,釋放出RNA,并通過不同方式去除蛋白,DNA等雜質,最終獲得高純度RNA產物的過程。

儀器及試劑

美析UL-1000超微量可見分光光度計

離心管 離心機 電泳槽 凝膠板

細胞樣品
RNA提取試劑盒 熒光定量PCR Mix TRIZOL dNTP氯仿 逆轉錄酶MMLV異丙醇Taq酶DEPC水ddH2O TE MgCl2瓊脂糖 溴化乙錠MOPS甲醛 乙酸鈉EDTA EB溴酚蘭
樣品RNA的抽提
1. 取凍存已裂解的細胞,室溫放置5分鐘使其完全溶解。
2. 兩相分離 每1 ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2 ml的氯仿,蓋緊管蓋。手動劇烈振蕩管體15秒后,15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12 000 rpm離心15分鐘。離心后混合液體將分為下層的紅色酚氯仿相,中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%。
3. RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,混勻后15到30℃孵育10分鐘后,于4℃下12 000 rpm離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊。
4. RNA清洗 移去上清液,每1 mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1 ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),清洗RNA沉淀。混勻后,4℃下7 000 rpm離心5分鐘。
5. RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液,使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘。
6. 溶解RNA沉淀 溶解RNA時,先加入無RNA酶的水4 0ul用槍反復吹打幾次,使其完全溶解,獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA質量檢測
1.紫外吸收法測定
先用稀釋用的TE溶液將紫外分光光度計調零。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值,測定RNA溶液濃度和純度。
(1)濃度測定
A260下讀值為1表示40 ug RNA/ml。樣品RNA濃度(μg/ml)計算公式為:A260x稀釋倍數x 40 ug/ml。具體計算如下:

RNA溶于40 ul DEPC水中,取5 ul,1:100稀釋至495 ul的TE中,測得A260= 0.21

RNA濃度= 0.21 x 100 x 40 ug/ml = 840 ug/ml或0.84 ug/ul

取5 ul用來測量以后,剩余樣品RNA為35 ul,剩余RNA總量為:

35 ul x 0.84 ug/ul = 29.4 ug

(2)純度檢測
RNA溶液的A260/A280的比值即為RNA純度,比值范圍1.8到2.1。
2. 變性瓊脂糖凝膠電泳測定
(1)制膠
1 g瓊脂糖溶于72 ml水中,冷卻至60℃,10 ml的10 x MOPS電泳緩沖液和18 ml的37%甲醛溶液(12.3 M)。
10x MOPS電泳緩沖液

濃度 成分

0.4 M MOPS,pH 7.0

0.1 M 乙酸鈉

0.01 M EDTA
灌制凝膠板,預留加樣孔至少可以加入25μl溶液。膠凝后取下梳子,將凝膠板放入電泳槽內,加足量的1xMOPS電泳緩沖液至覆蓋膠面幾個毫米。

(2)準備RNA樣品
取3 ugRNA,加3倍體積的甲醛上樣染液,加EB于甲醛上樣染液中至終濃度為10 ug/ml。加熱至70℃孵育15分鐘使樣品變性。

(3)電泳
上樣前凝膠須預電泳5 min,隨后將樣品加入上樣孔。5-6 V/cm電壓下2 h,電泳至溴酚蘭指示劑進膠至少2-3 cm。
(4)紫外透射光下觀察并拍照
28S和18S核糖體RNA的帶非常亮而濃(其大小決定于用于抽提RNA的物種類型),上面一條帶的密度大約是下面一條帶的2倍。還有可能觀察到一個更小稍微擴散的帶,它由低分子量的RNA(tRNA和5S核糖體RNA)組成。在18S和28S核糖體帶之間可以看到一片彌散的EB染色物質,可能是由mRNA和其它異型RNA組成。RNA制備過程中如果出現DNA污染,將會在28S核糖體RNA帶的上面出現,即更高分子量的彌散遷移物質或者帶,RNA的降解表現為核糖體RNA帶的彌散。用數碼照相機拍下電泳結果。

結果計算

RNA得率有很強的組織特異性,不同組織RNA的豐度和RNA提取的易難程度共同決定了該種組織的RNA得率。一般來說,可通過分光光度計測定RNA溶液在260nm處的吸光值來計算RNA的含量。RNA溶液在260、320、230、280nm下的吸光度分別代表了核酸、溶液渾濁度、雜質濃度和蛋白等有機物的吸收值。用標準樣品測得在波長260nm處,1ug/mlRNA鈉吸光度0.025(光程為1cm),即OD260=1時,樣品中RNA濃度為40ug/ml。通常分光光度計OD260的讀數要介于0.15-1.0之間才是可靠的。因此RNA提取結束后,要根據大概產量稀釋到適當濃度范圍,再用分光光度計檢測。按下面的共識計算總RNA濃度:

總RNA濃度(ug/ml)=OD260×稀釋倍數×40ug/ml

關于我們

上海美析儀器公司簡介

上海美析儀器有限公司(以下簡稱美析),是一家具有自主知識產權的高新技術企業,美析的創業理念“科技——因你改變”,并以此為企業宗旨,不斷探究、果敢創新。特別是在分析測試儀器領域,不斷開發出先進的產品,使美析成為優質儀器資源的供應者。

美析主營光譜類儀器可見分光光度計、紫外可見分光光度計、原子吸收光譜儀、超微量分光光度計、原子熒光光度計、ICP電感耦合等離子體發射光譜儀、ICP電感耦合等離子體質譜儀,目前,我們的產品已廣泛應用于有機化學、無機化學、生物化學、醫藥、環保、冶金、石油、農業等領域。同時美析利用在產品機械結構、光學設計、電氣應用和軟件開發方面積累的豐富經驗,結合市場的最新實際需求,近期將陸續推出一批全新的分析類儀器。

美析的總部及生產基地設在上海,營銷中心設在北京,并在江蘇、上海、山東三地建有研發基地。為充分利用各地的智力資源,美析與國內外的部分科研單位也進行了深層次的科研合作,不斷將科研成果轉化為生產力。為更好的服務于廣大客戶,美析儀器國內設有12家辦事機構,度身定制符合您需求的應用解決方案,提高產品的附加值。在不斷服務國內用戶的同時,美析也與20多個國家的分銷機構建立了深度的戰略合作關系。

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(美析儀器不僅僅只是一家高新技術認證企業,更通過了CE認證、FCC認證、RoHS認證以及國內多項資質審查認證,并有著多項自行研發的光譜類專利版權等等)

審核編輯 黃昊宇

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