近日，中科院長春光機所應用光學國家重點實驗室利用微流控技術，將微滴生成、PCR擴增和熒光檢測等環節進行集成，運用連續流動式PCR擴增方法，實現了“樣本進、結果出”的一體化數字PCR系統。

數字PCR也叫Digital PCR（dPCR），是一種核酸分子絕對定量技術。相較于傳統熒光定量PCR(qPCR)來說，dPCR對結果的判定不依賴于擴增曲線循環Ct值，不受擴增效率的影響，能夠直接讀出DNA的分子個數，是對起始樣本核酸分的子絕對定量。dPCR一般包括三部分內容，即樣本離散、PCR擴增和熒光信號分析。與傳統技術不同，dPCR一般需要將樣品稀釋到單分子水平，并平均分配到幾十至幾萬個單元。每一個反應單元獨立進行PCR擴增反應。不同于qPCR對每個循環進行實時熒光測定的方法，dPCR技術是在擴增結束后對每個反應單元的熒光信號進行采集。最后通過直接計數或泊松分布公式計算得到樣品的原始濃度或含量。針對這一檢測流程，提出了一種連續流動式、全自動、一體化集成數字PCR系統，只需要一次進樣就可同步實現微液滴生成、熱循環擴增以及核酸絕對定量分析的整個dPCR檢測流程。

圖1 數字PCR原理及檢測過程

如圖2所示該系統主要由液滴生成及流體驅動裝置、PCR擴增芯片及溫度控制裝置、數字液滴熒光檢測裝置組成。雙路高精度注射泵驅動水相與油相液體經Y型液滴生成裝置，產生包裹有單分子級別DNA的液滴；液滴沿Teflon管道連續流過多個恒溫加熱區，從而實現DNA的擴增；利用470 nm光源激發反應后液滴內的熒光探針，并由CMOS進行信號的捕捉。該系統將全部檢測流程集成于一臺設備內，由鋰電系統為整個系統供能，并設計了相配套的上位機控制及數據分析軟件。與傳統由多臺設備共同組成的dPCR檢測系統不同，該系統無需在實驗中途進行人工樣本轉移等操作，只需將待檢測樣本加入該系統，就可得到樣本的定量檢測結果。

圖2 系統組成示意圖

研究團隊利用該系統完成了人體血清內HBV病毒的定量檢測，對病毒濃度為

103- 105IU/mL的血清樣本進行測試，其液滴熒光強度分布與分布頻率如圖3所示，可以看出，隨模板濃度逐漸增高，其陰性液滴占比也逐漸減少。如圖4所示，液滴統計結果通過泊松分布校正，可計算出模板中DNA分子的絕對濃度，并與商用定量PCR儀結果進行比較，從圖5可以看出，其結果具有很強的線性相關度，經多次重復實驗驗證，檢測結果具有較高的可重復性和定量精度。

圖3 (a-c)液滴熒光強度分布及頻率分布 (d)液滴熒光圖像

圖4 樣本濃度檢測結果

圖5 dPCR與qPCR檢測結果的比較

綜上所述，該系統具有較高的集成度和自動化程度，在便攜性和操作難易程度上具有一定的優勢，為現場檢測奠定了基礎。該系統在低水平病原體檢測、病毒載荷絕對定量、罕見等位基因檢測、拷貝數變異分析等領域具有廣泛的應用前景。相關工作以“Fully automatic integrated continuous-flow digital PCR device for absolute DNA quantification”為題發表于《Analytica Chimica Acta》。