腫瘤細(xì)胞間的交流對(duì)腫瘤的發(fā)生及發(fā)展具有重要意義。細(xì)胞外囊泡（EVs）是細(xì)胞分泌的納米或微米尺度的囊泡，通常根據(jù)其大小或形成/釋放途徑分為外泌體、微囊泡和凋亡小體等。近年來(lái)，研究證實(shí)EVs是細(xì)胞間重要的信號(hào)傳遞載體，EVs正在成為新興的有前景的癌癥診斷生物標(biāo)志物。2016年，日本科學(xué)家Yoshinori Ohsumi因揭示自噬機(jī)制而獲得諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。該機(jī)制中，自噬被描述為一種分解代謝途徑。但最新研究表明，自噬小體可以從細(xì)胞內(nèi)降解途徑轉(zhuǎn)化為細(xì)胞外分泌途徑，形成另一種EV類型，即分泌型自噬小體。最近的研究表明，分泌型自噬小體與腫瘤細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移及不良預(yù)后相關(guān)，揭示了分泌型自噬小體在腫瘤進(jìn)展研究中的潛在作用。因此，更好地了解分泌型自噬小體內(nèi)部或表面的內(nèi)容物對(duì)實(shí)現(xiàn)癌癥診斷和探索其在癌癥進(jìn)展中的作用具有重要意義。

近期，東南大學(xué)劉松琴教授課題組報(bào)道了一種三維微流控芯片，用于分泌型自噬小體的高效捕獲與表面蛋白靈敏檢測(cè)（圖1）。相關(guān)成果以“Three-Dimensional Microfluidic Chip for Efficient Capture of Secretory Autophagosomes and Sensitive Detection of Their Surface Proteins”為題發(fā)表在國(guó)際化學(xué)權(quán)威雜志Analytical Chemistry上。論文通訊作者為劉松琴教授，共同第一作者為青年教師華鑫及碩士生劉晰。

圖1 基于三維微流控芯片的分泌型自噬小體高效捕獲與表面蛋白檢測(cè)示意圖

研究人員構(gòu)建了一種具有紡錘形微柱陣列結(jié)構(gòu)和明膠逐層修飾的三維（3D）微流控芯片（圖2）。之前的研究表明，微柱陣列可以在流體通過(guò)微通道時(shí)產(chǎn)生各向異性流動(dòng)，從而增加溶液中的反應(yīng)物與微通道表面之間的接觸概率。有限元模擬結(jié)果表明，微柱陣列中存在一個(gè)非對(duì)稱流分叉，這種各向異性流動(dòng)可以增強(qiáng)相對(duì)較大的自噬小體在LC3B抗體修飾微通道表面的傳質(zhì)。流體流過(guò)陣列通道的時(shí)間越長(zhǎng)，自噬小體與抗體發(fā)生反應(yīng)的機(jī)會(huì)就越大。此外，由于橫截面上速度分布不均勻?qū)е碌亩蜠ean流進(jìn)一步增加了自噬小體與LC3B修飾微通道表面相互作用的概率。另外，通過(guò)多層生物素化明膠修飾，增加了捕獲抗體的固定位點(diǎn)。因此，3D芯片的自噬小體捕獲效率（74%）明顯高于未修飾的平板芯片（47%）。

圖2 （A）微流控芯片設(shè)計(jì)圖；（B）分布在芯片內(nèi)的梭狀微柱陣列的SEM圖像；（C-D）有限元模擬通道寬度方向上的流動(dòng)模式（C）和通道長(zhǎng)度方向上的橫向流動(dòng)剖面圖（D）；（E-F）CLSM對(duì)涂有生物素化明膠薄膜和鏈霉親和素-FITC的芯片進(jìn)行平面掃描（E）和3D掃描（F）圖像。

利用所制備的兩種抗體-量子點(diǎn)偶聯(lián)探針，該芯片采用兩步免疫反應(yīng)及熒光分析，成功捕獲并檢測(cè)了卵巢癌細(xì)胞分泌的自噬小體。結(jié)果表明，該芯片可對(duì)分泌型自噬小體表面的兩種蛋白LC3B和HSP60實(shí)現(xiàn)靈敏檢測(cè)，檢出限（LODs）分別為141粒子/μL和126粒子/μL。此外，自噬小體上LC3B和HSP60的表達(dá)均可用于區(qū)分癌癥患者和健康人群的血清樣本，其p值分別小于0.01（具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）和0.05（具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異）。另外，LC3B與HSP60信號(hào)加和的p值小于0.001（具有極顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異），表明該芯片在癌癥診斷方面具有良好的應(yīng)用潛力（圖3）。

圖3（A）在PBS和健康人血清中添加自噬小體標(biāo)樣LC3B的檢測(cè)；（B）兩種細(xì)胞在相同體積的細(xì)胞培養(yǎng)上清中收集的自噬小體中LC3B和HSP60的表達(dá)；（C）卵巢癌患者臨床標(biāo)本與正常人自噬小體LC3B和HSP60表達(dá)比較；（D）卵巢癌患者和正常人的臨床樣本中自噬小體LC3B和HSP60信號(hào)的總和。（*p＜0.05，**p＜0.01和***p＜0.001）。

綜上所述，研究人員設(shè)計(jì)了一種用于分泌型自噬小體分離檢測(cè)的三維微流控芯片。芯片采用梭狀微陣列結(jié)構(gòu)和明膠層修飾，不僅增加了芯片內(nèi)部的表面積，也增加了流體和芯片之間的接觸時(shí)間和抗體的修飾位點(diǎn)，大大增強(qiáng)了自噬小體的捕獲效率。隨后，采用兩種抗體偶聯(lián)量子點(diǎn)探針，實(shí)現(xiàn)了芯片中多個(gè)自噬小體表面蛋白的同時(shí)檢測(cè)，靈敏度高、樣品消耗低。此外，對(duì)臨床血清樣本中的自噬小體檢測(cè)結(jié)果表明，該芯片在準(zhǔn)確區(qū)分癌癥患者和健康人群方面具有良好的可行性，這表明該策略在臨床癌癥診斷中具有良好的應(yīng)用前景。

論文鏈接：

https://doi.org/10.1021/acs.analchem.2c01419

編輯：黃飛