基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）

1、基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）研究的意義

細胞中基因的表達是嚴格按照時間和空間順序發生，因此細胞類型和基因表達具有時間特異性和空間特異性。時間特異性可以通過收集不同時間點的樣本進行單細胞轉錄組測序分析。但是scRNA-Seq在單細胞懸液制備過程中破壞了細胞的空間結構，無法給出固態異質化組織中細胞空間排布信息。因傳統的單細胞基因研究喪失了細胞的空間信息，而機體的細胞發揮作用也是與細胞所處的空間位置和環境信息有關的。空間轉錄組可以解決這些問題，通過組織切片細胞的空間信息，在保留組織形態結構的基礎上，獲得細胞/基因/蛋白質的空間表達特異性。

目前可以用于研究細胞空間位置信息的方法有兩種：“熒光原位雜化后基于光學成像”和“基于測序技術”的空間分子圖譜分析。熒光原位雜化后基于光學成像方法技術難度高，且耗時、通量低，只能分析有限的知道序列的mRNAs，不易推廣到其他組學。DBiT-seq技術的RNA逆轉錄過程是在細胞內進行的，而不是釋放細胞進行。目前該領域的研究空間分辨率可以達到10um，接近單細胞水平。

2、基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）的原理

如圖1所示：基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）的原理是利用微流控芯片技術，對切片組織進行編碼，通過在組織中使用確定性條形碼進行空間組測序，從而實現在切片組織中共同繪制mRNA和蛋白質定位。

圖1

3、基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）的實驗流程

基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）的實驗流程一般包含如下步驟，如圖2所示：

(1)組織切片制備、優化后固定放置在載玻片上

(2)向組織切片添加DNA抗體偶聯物的混合物（ADTs）

(3)將1片PDMS材質的空間轉錄芯片覆蓋在組織切片上，然后放置于空間轉錄夾具，整個微流控裝置采用負壓進樣，給切片組織標記條碼A1,A2......A50，Am和ADTs；

(4)將前一步的PDMS空間轉錄芯片取下，更換新的1片PDMS材質的空間轉錄芯片，進樣方向與上一步垂直，給切片組織標記條碼B1,B2......B50，Bn和ADTs

(5)以上步驟，完成了基于微流體條碼標記的切片組織，然后可以進行組織成像；組織成像之后，提取并收集組織中的cDNA，采用NGS或者其他技術進行高通量測序。這里測序得到的基因，帶有二維（Am，Bn）的位置信息，因此可以獲得細胞/基因/蛋白質的空間對應信息。

圖2

4、基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）的應用

(1)病理學研究：通過添加基因表達維度，得出形態學結論；

(2)免疫學研究：研究免疫細胞中的基因表達特征、免疫細胞的浸潤表現等；

(3)發育生物學研究：用于發現組織背景中與形態形成有關的基因等；

(4)神經科學研究：用于繪制大腦的各個細胞層、區分正常與患病的大腦解剖特征等；

(5)腫瘤學研究：如腫瘤微環境、腫瘤異質性、病程進展、癌癥形態、腫瘤浸潤淋巴細胞相關基因表達等。

5、基于微流體條碼標記的空間多組學測序技術（DBiT-seq技術）研究的夾具和芯片

所示是空間轉錄夾具ZXDBiT-seq01，該款夾具可以實現對空間轉錄芯片的裝配固定和負壓進樣操作，夾具由金屬和樹脂材料加工而成，四周螺絲鎖緊，使用簡便，不易漏液。該款夾具適配圖4所示的空間轉錄芯片，材質為PDMS，每組空間轉錄芯片包含2片芯片，從而實現圖2所示垂直兩個方向的標記物（50種）進樣操作。

所示的夾具和芯片是標準品，可根據課題研究需要定制加工更高分辨率和更多標記條碼的產品。