質(zhì)譜成像是一種結(jié)合質(zhì)譜分析的分子成像技術(shù)，可以同時獲得分子的空間分布信息和化學(xué)結(jié)構(gòu)信息，在生物標(biāo)記物的靶向分析以及疾病標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)中有著重要的意義。日前，清華大學(xué)精密儀器系歐陽證、馬瀟瀟教授課題組與材料學(xué)院鐘毓霖教授課題組合作，利用以銅為基底的微納米復(fù)合錐體陣列抗反射材料（對紫外輻射平均吸收率高達(dá)97％），實現(xiàn)了無需基質(zhì)的激光解吸附離子化質(zhì)譜分析。

研究背景

基質(zhì)輔助激光解吸附離子化（matrix-assisted laser desorption/ionization， MALDI）質(zhì)譜技術(shù)使用紫外激光掃描樣品表面獲得質(zhì)譜信息，是目前應(yīng)用最廣泛的質(zhì)譜成像技術(shù)，尤其適合生物大分子和高聚物的分析。該技術(shù)是采用短的脈沖激光（1-10ns）使樣品分子離子化后進(jìn)入質(zhì)譜儀分析。

但傳統(tǒng)MALDI質(zhì)譜成像需要在組織切片表面均勻噴涂小分子基質(zhì)，不僅流程繁瑣耗時，還可能改變分析物在組織中的分布。此外，基質(zhì)使用及噴涂不均勻會造成低質(zhì)量端背景干擾、成像重現(xiàn)性差、空間分辨率低等一系列問題。

近些年來，研究人員開發(fā)了一系列固體基底材料替代小分子基質(zhì)實現(xiàn)激光解吸附離子化（laser desorption/ionization， LDI），主要包括納米材料、納米結(jié)構(gòu)和納米粒子等。目前，大部分LDI基底材料仍存在制備過程復(fù)雜、使用壽命短、易被污染、離子化效率低等問題，發(fā)展一種高效耐用的基底材料是提高LDI質(zhì)譜檢測實用性和有效性的關(guān)鍵。

研究進(jìn)展

為解決上述問題，清華大學(xué)精密儀器系歐陽證教授和馬瀟瀟教授團(tuán)隊近年來致力于發(fā)展無基質(zhì)激光解吸附離子化（LDI）質(zhì)譜成像技術(shù)。通過與清華大學(xué)材料學(xué)院鐘敏霖教授合作，利用一種新型高效抗反射（anti-reflection， AR）金屬材料做載樣基底，可在不使用基質(zhì)化合物的情況下實現(xiàn)樣品分子的激光解吸附和離子化（圖1），提高分析速度，避免背景干擾。

該材料通過一步超快激光刻蝕在銅表面原位加工制成（圖1（b）），具有周期性微米級錐孔陣列結(jié)構(gòu)和表面覆蓋的大量納米顆粒結(jié)構(gòu)（圖1（c）），可有效束縛和吸收入射光，對紫外輻射的平均吸收率高達(dá)97％。因此，AR材料可以有效捕獲LDI紫外激光（355 nm）并將其轉(zhuǎn)換成熱能，促進(jìn)分析物發(fā)生“局部爆炸”，實現(xiàn)解吸附和后續(xù)的離子化過程。該抗反射材料結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，清洗后可重復(fù)使用200——400次。

圖1 （a） 使用抗反射材料做LDI基底檢測酵母細(xì)胞樣本的原理示意圖，箭頭表示光捕獲原理

圖1（b）抗反射材料（黑色區(qū)域為抗反射材料）; （c）抗反射材料掃描電鏡圖; （d） 酵母細(xì)胞的AR-LDI質(zhì)譜圖，酵母細(xì)胞直接滴加至材料表面，可檢測到多種代謝物離子峰

2018年，該團(tuán)隊在Research上發(fā)表了基于抗反射材料的激光解吸附離子化質(zhì)譜檢測方法（Research， 2018， DOI： 10.1155/2018/5439729）。采用銅微納復(fù)合錐體陣列抗反射材料（對紫外輻射平均吸收率高達(dá)97％）為基底，實現(xiàn)了無需基質(zhì)的激光解吸附離子化，以及對糖類、氨基酸、藥物分子等生物小分子的高靈敏度檢測和對洋蔥提取液和酵母細(xì)胞中代謝物的快速直接質(zhì)譜檢測。

然而，銅材料的高導(dǎo)熱性會造成局部熱量的擴(kuò)散，并降低質(zhì)譜檢測靈敏度。為減少熱量擴(kuò)散，該團(tuán)隊采用熱導(dǎo)率更低的不銹鋼，并在表面修飾聚多巴胺（polydopamine，PDA）制備不銹鋼抗反射復(fù)合材料，進(jìn)一步提高了質(zhì)譜分析的靈敏度和生物分析的兼容性。PDA具有合成方便、穩(wěn)定、可修飾到多種表面、良好的生物相容性等優(yōu)點。同時，PDA在300 nm附近的強(qiáng)光吸收可有效增強(qiáng)激光解吸離子化效率。質(zhì)譜分析和成像結(jié)果表明，聚多巴胺-不銹鋼抗反射復(fù)合材料具有良好的解吸附離子化特性，可用于生物組織中甘油三酯（TAG）、甘油二酯（DAG）、磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺（PE）、鞘磷脂（SM）、膽固醇酯（CE）以及溶血磷脂酰膽堿（Lyso PC）的高效質(zhì)譜檢測。對鼠腦組織切片的高分辨率（50 μm）質(zhì)譜成像同時獲得了20余種磷脂分子的空間分布和結(jié)構(gòu)信息，表明磷脂分子在小鼠大腦灰質(zhì)區(qū)、白質(zhì)區(qū)和胼胝體呈現(xiàn)截然不同的區(qū)域和豐度分布（圖2）。

圖2. （a）不銹鋼抗反射材料（AR-SS）和聚多巴胺修飾的不銹鋼抗反射材料（PDA-AR-SS）的掃描電鏡圖。（b）使用PDA-AR-SS做基底實現(xiàn)LDI質(zhì)譜成像的原理示意圖；（c）使用PDA-AR-SS對鼠腦組織切片的質(zhì)譜成像結(jié)果。

清華團(tuán)隊利用該方法研究了肥胖小鼠（ob/ob）肝臟組織中的脂類含量和分布（圖2）。實驗結(jié)果表明，相比正常小鼠，肥胖小鼠肝組織中的甘油三酯含量顯著增加，并呈離散狀分布；而正常小鼠肝臟組織中PC、PE等分子的含量更高。以上結(jié)果表明聚多巴胺-不銹鋼微納復(fù)合抗反射材料可實現(xiàn)高空間分辨率質(zhì)譜成像，無需在生物組織上噴覆基質(zhì)，從而大大簡化了分析流程，避免了基質(zhì)背景干擾，且基底材料清洗后可反復(fù)使用200次以上，對推動質(zhì)譜成像在疾病診斷等領(lǐng)域的應(yīng)用具有重要意義。

圖3. 使用PDA-AR-SS做基底，對肥胖小鼠和正常小鼠肝臟組織的LDI質(zhì)譜成像。

上述研究成果近期發(fā)表在ACS Applied Materials & Interfaces 上（ACS Appl. Mater. Interfaces 2019， 11， 49， 46140-46148， DOI： 10.1021/acsami.9b16260）。

未來展望

該抗反射金屬材料可用于多種生物分子的高靈敏度檢測，為激光解吸附和離子化質(zhì)譜提供了一種通用、高效、快速的軟離子化技術(shù)，可用于大量生物樣品的高通量分析。之后，該團(tuán)隊又通過對該材料表面的多巴胺修飾，改善了材料的生物相容性及質(zhì)譜檢測靈敏度，且避免了常規(guī)質(zhì)譜成像的繁瑣、耗時的基質(zhì)噴涂流程，大大簡化質(zhì)譜成像流程。

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