真菌毒素被認(rèn)為是食源性疾病的最重要原因之一，并受到全球范圍內(nèi)的長(zhǎng)期關(guān)注。隨著公共衛(wèi)生意識(shí)的提高，一些組織已經(jīng)為食品中的真菌毒素設(shè)定了最大殘留限度（MRLS），以避免高風(fēng)險(xiǎn)行為。然而，大多數(shù)真菌毒素以微量的形式存在，對(duì)食品安全構(gòu)成了嚴(yán)重威脅。此外，存在于同一食品中的多種毒素的協(xié)同或拮抗作用增加了對(duì)人和動(dòng)物的毒性。而面對(duì)物流全球化的發(fā)展趨勢(shì)，傳統(tǒng)的真菌毒素分析方法如高效液相色譜法（HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜法（LC-MS）由于程序復(fù)雜、設(shè)備笨重、操作復(fù)雜，在一定程度上限制了其實(shí)際應(yīng)用。因此，建立和開(kāi)發(fā)針對(duì)多種真菌毒素的靈敏、快速、準(zhǔn)確的高通量檢測(cè)方法，以滿足食品質(zhì)量安全的要求已迫在眉睫。

為解決以上問(wèn)題，淮陰師范學(xué)院、中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院海南醫(yī)院和清華大學(xué)聯(lián)合研發(fā)了基于功能性DNA調(diào)節(jié)和過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的超敏微流控生物傳感器（FTMB），實(shí)現(xiàn)了6種真菌毒素的同時(shí)定量檢測(cè)。在該系統(tǒng)中，觸發(fā)開(kāi)關(guān)的高響應(yīng)性不受傳感界面的空間限制，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制使其能夠在復(fù)雜的生物背景下靈敏而特異地檢測(cè)小分子目標(biāo)，能使真菌毒素和熒光信號(hào)之間建立直接的線性正相關(guān)。此外，該研究還進(jìn)一步開(kāi)發(fā)了具有高響應(yīng)特性的過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)并評(píng)價(jià)了微流控芯片中流道對(duì)流體的操縱以及PC基底對(duì)量子點(diǎn)探針熒光的增強(qiáng)作用。所構(gòu)建的FTMB系統(tǒng)具有小型化、批量生產(chǎn)和可調(diào)性等優(yōu)點(diǎn)，在實(shí)際樣品分析中表現(xiàn)良好，具有高通量、準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性，為多種真菌毒素的快速檢測(cè)提供了良好的平臺(tái)。相關(guān)工作以“Microfluidic Biosensor Integrated with Signal Transduction and EnhancementMechanism for Ultrasensitive Noncompetitive Assay of Multiple Mycotoxins”為題發(fā)表在Analytical chemistry期刊上。

圖1 FTMB系統(tǒng)的檢測(cè)原理圖 ?

CRISPR/Cas12a雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的可行性

為了進(jìn)一步確證功能DNA在真菌毒素檢測(cè)中的轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的實(shí)用性，研究人員將功能DNA調(diào)控的CRISPR系統(tǒng)激活機(jī)制分別采用單鏈DNA（ssDNA，19nt）和FAM標(biāo)記的Cas12a通用型DNA探針（FAM-TTATT-BHQ1）。如圖2A所示，在沒(méi)有相應(yīng)激活子的反應(yīng)體系中，ssDNA保持完整（通道1-2）。在使用功能性DNA鎖定激活子（通道3-8）時(shí)，成功限制了CRISPR系統(tǒng)的裂解功能。在此基礎(chǔ)上，在相應(yīng)的真菌毒素（100 ng/mL）存在的情況下，6種真菌毒素的激活子可以觸發(fā)相應(yīng)的CRISPR系統(tǒng)的反式切割活性，使ssDNA被切割成隨機(jī)短片段（通道9-14）。這種降解現(xiàn)象表明，6種適配子-1/激活子/適配子-2作為觸發(fā)開(kāi)關(guān)可以成功啟動(dòng)后續(xù)的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。

為了驗(yàn)證聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，基于功能DNA的觸發(fā)開(kāi)關(guān)在常規(guī)CRISPR/12a熒光檢測(cè)系統(tǒng)中被進(jìn)一步測(cè)試。實(shí)時(shí)熒光曲線顯示，在激活子不存在或鎖定時(shí)，熒光信號(hào)幾乎不積累，而在激活子存在或解鎖時(shí)，熒光值迅速增加（圖2B）。根據(jù)熒光測(cè)試結(jié)果（圖2C），功能DNA與激活子的最佳配比均為2:1。聚丙烯酰胺凝膠電泳和熒光定量分析結(jié)果表明，功能DNA具有識(shí)別目標(biāo)分子的能力，同時(shí)激活子被成功鎖定。

為了進(jìn)一步提高傳感器的檢測(cè)靈敏度和抗干擾能力，選用QDs作為一種全新的CRISPR系統(tǒng)探針的供體材料。與常規(guī)CRISPR探針相比，QDs的窄帶發(fā)射光譜和高的量子產(chǎn)率有利于高度匹配光子晶體的光子帶隙。此外，得益于QDs的寬吸收光譜，信號(hào)輸出可以在簡(jiǎn)單的紫外燈照射下實(shí)現(xiàn)。考慮到綠色熒光波段是最常見(jiàn)的檢測(cè)輸出信號(hào)，因此選擇發(fā)射波長(zhǎng)為520 nm的QDs。為了構(gòu)建適合CRISPR系統(tǒng)的FRET模型，將含有淬滅基團(tuán)BHQ1的DNA報(bào)告子修飾在量子點(diǎn)的表面，實(shí)現(xiàn)熒光猝滅。DNA報(bào)告子的濃度被進(jìn)一步優(yōu)化以達(dá)到最佳的猝滅效率。如圖2D，猝滅效率隨報(bào)告子濃度的增加而增加，直至在6 nmol（~100%）時(shí)達(dá)到完全猝滅。

圖2 CRISPR/Cas12a雙重轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的可行性 ?

用于真菌毒素檢測(cè)的過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的建立

同時(shí)具有不同形式Cas12a酶（封閉、中間和開(kāi)啟）處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)很容易用少量的激活子改變這種平衡，這有利于激活更多的Cas12a酶，從而使整體反式裂解活性大幅度提高。因此，推測(cè)CRISPR系統(tǒng)最敏感的狀態(tài)是亞穩(wěn)態(tài)，即使是少量的激活子也可以很容易地激活Cas12a酶，誘導(dǎo)較強(qiáng)的裂解活性。由圖3A（2）可以看出，在激活子濃度相同的情況下，不同crRNA對(duì)應(yīng)的CRISPR體系的反式切割活性不同。這是因?yàn)閱蝹€(gè)CRISPR系統(tǒng)的裂解活性是由多組分的性質(zhì)共同驅(qū)動(dòng)的，組分的結(jié)構(gòu)和比例會(huì)對(duì)整個(gè)CRISPR系統(tǒng)的特性產(chǎn)生不同的影響。根據(jù)所選擇的能夠刺激Cas12a酶高活性的crRNA和激活子序列，調(diào)整組成比例有助于實(shí)現(xiàn)對(duì)低濃度目標(biāo)真菌毒素的高響應(yīng)。

為了確定分子開(kāi)關(guān)的過(guò)渡狀態(tài)，研究人員首先評(píng)估了激活復(fù)合物（crRNA/激活子）對(duì)Cas12a酶的影響。對(duì)于固定濃度的Cas12a酶，激活復(fù)合物濃度增加至4 nM以上（保持crRNA：激活子的比例為1:1），Cas12a酶的附屬切割活性顯著提升（圖3B）。通過(guò)繪制激活曲線的一階導(dǎo)數(shù)，研究人員將分子開(kāi)關(guān)分為三組，即開(kāi)啟、過(guò)渡和關(guān)閉（圖3B插圖）。用高濃度的激活復(fù)合物（>8 nM）制作開(kāi)啟態(tài)CRISPR系統(tǒng)。在響應(yīng)范圍內(nèi)，用中等濃度的激活復(fù)合物制備過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)，并對(duì)激活復(fù)合物濃度的變化保持響應(yīng)（即，在Cas12a酶反應(yīng)速率最高的頂點(diǎn)，用5.32 nM的激活復(fù)合物制作高響應(yīng)CRISPR系統(tǒng)）。用低濃度的激活復(fù)合物（<3 nM）制成了封閉狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)。當(dāng)研究人員通過(guò)減少激活子的數(shù)量（即降低增強(qiáng)子：crRNA的比例）來(lái)擾亂系統(tǒng)時(shí)，處于響應(yīng)狀態(tài)的CRISPR系統(tǒng)顯示出Cas12a酶附屬切割活性的巨大變化（圖3C）。

為了建立過(guò)渡態(tài)，研究人員進(jìn)一步調(diào)整激活子的數(shù)量（即由功能性DNA鎖定，通過(guò)觸發(fā)開(kāi)關(guān)與目標(biāo)結(jié)合被釋放），同時(shí)保持crRNA的數(shù)量不變（圖3D）。通過(guò)此優(yōu)化，研究人員將過(guò)渡狀態(tài)定義為一階導(dǎo)數(shù)抑制圖（圖3D，插圖）上的頂點(diǎn)。這種被識(shí)別的過(guò)渡狀態(tài)表明其反應(yīng)性進(jìn)一步提高，Cas12a酶附屬切割速率最大，而開(kāi)啟和封閉狀態(tài)CRISPR系統(tǒng)不能產(chǎn)生任何可識(shí)別的信號(hào)（圖3E）。比例調(diào)節(jié)的Cas12a酶不僅在與互補(bǔ)的目標(biāo)毒素分子孵育時(shí)表現(xiàn)出顯著的附屬切割活性，而且在與非目標(biāo)分子孵育時(shí)也保持低背景活性。針對(duì)六種真菌毒素設(shè)計(jì)的過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)都實(shí)現(xiàn)了更快的激活動(dòng)力學(xué)。與在其它狀態(tài)下準(zhǔn)備的開(kāi)關(guān)相比，過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)能夠快速激活Cas12a酶。在室溫孵育40 min內(nèi)，可以識(shí)別低濃度靶標(biāo)。

圖3 用于真菌毒素檢測(cè)的過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的建立

壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片的液體流動(dòng)測(cè)試

微流控芯片上的流體控制是真菌毒素高通量檢測(cè)的重要保證。為確定反應(yīng)液在各室的均勻分布，采用添加紅色染料的反應(yīng)液（上方25 μL礦物油）進(jìn)行流體測(cè)試。流道設(shè)計(jì)受到自然分形樹(shù)系統(tǒng)的啟發(fā)，確保入口施加的壓力均勻分布在腔室上，以引導(dǎo)液體流動(dòng)的劃分。這種分區(qū)方式的均勻性不受注入過(guò)程中壓力變化的影響，保證了100%的分區(qū)效率，利于用戶的友好使用。從圖4中可以看出，紅色液體均勻分布在左右八個(gè)檢測(cè)室中，并被后續(xù)的礦物油隔離，避免交叉污染。芯片底部設(shè)計(jì)的排氣通道利用毛細(xì)管效應(yīng)形成一個(gè)截止閥，使腔內(nèi)的空氣排出，但液體不能流出。為了保證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究分別采用右側(cè)的2個(gè)腔室作為陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照，另外6個(gè)腔室用于不同真菌毒素的檢測(cè)。此外，基于不同分形維數(shù)和分支級(jí)別的芯片設(shè)計(jì)，該策略可以進(jìn)一步擴(kuò)展為更高通量的檢測(cè)方案。

圖4 壓力驅(qū)動(dòng)微流控芯片的組成和整個(gè)操作流程

FTMB系統(tǒng)的分析性能

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，F(xiàn)TMB檢測(cè)系統(tǒng)中各真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)曲線被構(gòu)建。如圖 5A所示，F(xiàn)TMB系統(tǒng)傳感位點(diǎn)的亮度隨著真菌毒素濃度的增加而增加，這并不遵循競(jìng)爭(zhēng)免疫分析法的原理。FTMB系統(tǒng)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制不需要與目標(biāo)類(lèi)似物競(jìng)爭(zhēng)，通過(guò)減少信號(hào)標(biāo)記修飾的識(shí)別分子的數(shù)量來(lái)實(shí)現(xiàn)量化。因此，F(xiàn)TMB系統(tǒng)中各位點(diǎn)的熒光強(qiáng)度與目標(biāo)真菌毒素濃度呈正相關(guān)，這有利于檢測(cè)靈敏度的提高。由Michaelis-Menten方程得到的AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON的標(biāo)準(zhǔn)回歸曲線（圖5A）。R2值范圍為 0.949 ~0.989，表明在檢測(cè)范圍內(nèi)具有良好的相關(guān)系數(shù)。從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2和DON的檢測(cè)限（LOD）分別為 2.3 fg/mL、3.9 fg/mL、2.6 fg/mL、1.4 fg/mL、1.7?fg/mL 和 1.5 fg/mL。

為了進(jìn)一步評(píng)估FTMB系統(tǒng)對(duì)單一和多重檢測(cè)的特異性，F(xiàn)TMB系統(tǒng)對(duì)單個(gè)AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON及其混合物的熒光響應(yīng)被研究（圖5B）。通過(guò)對(duì)AFB?、OTA、ZEN、FB?、T-2、DON等6種真菌毒素的單獨(dú)檢測(cè)，各檢測(cè)單元對(duì)應(yīng)的目標(biāo)毒素可觸發(fā)單元內(nèi)的CRISPR反應(yīng)從而恢復(fù)QDs的熒光。檢測(cè)單元對(duì)非目標(biāo)毒素?zé)o反應(yīng)，信號(hào)值與空白對(duì)照相似。對(duì)于多重檢測(cè)，當(dāng)對(duì)多種真菌毒素的不同組合（2-plex、3-plex、4-plex和5-plex）進(jìn)行測(cè)試時(shí)，F(xiàn)TMB系統(tǒng)也提供了準(zhǔn)確的結(jié)果。在需要制備半抗原的競(jìng)爭(zhēng)性免疫測(cè)定中，某些真菌毒素（如AFB?）在紫外線下的自發(fā)熒光可能會(huì)干擾結(jié)果的判讀。而FTMB系統(tǒng)通過(guò)觸發(fā)級(jí)聯(lián)反應(yīng)發(fā)出熒光，則不受其影響。這些結(jié)果表明，F(xiàn)TMB系統(tǒng)的非競(jìng)爭(zhēng)性檢測(cè)方法能夠準(zhǔn)確、特異地檢測(cè)出單重或者多重目標(biāo)毒素。

圖5 FTMB分析性能

綜上所述，該項(xiàng)研究成功開(kāi)發(fā)了一種基于功能性DNA調(diào)節(jié)和過(guò)渡態(tài)CRISPR系統(tǒng)的超敏微流控生物傳感器，可以實(shí)現(xiàn)食品中真菌毒素的高通量識(shí)別。該傳感器通過(guò)設(shè)計(jì)的觸發(fā)開(kāi)關(guān)建立了Cas12a酶的程序化側(cè)枝裂解活性與霉菌毒素濃度之間的正相關(guān)關(guān)系。在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面，高靈敏度的過(guò)渡態(tài)被認(rèn)為是提高CRISPR/Cas12a系統(tǒng)識(shí)別能力的關(guān)鍵因素。調(diào)整Cas12a酶的開(kāi)放狀態(tài)和關(guān)閉狀態(tài)的比值對(duì)FTMB的分析性能有積極的影響。在增強(qiáng)信號(hào)方面，通過(guò)設(shè)計(jì)發(fā)射波段與芯片內(nèi)光子帶隙高度匹配的量子點(diǎn)探針實(shí)現(xiàn)了信號(hào)顯著增強(qiáng)至45.6倍。該方法不需要對(duì)人體和環(huán)境造成生物危害的真菌毒素-蛋白偶聯(lián)物，也不需要制備復(fù)雜、繁瑣的抗體。為了進(jìn)一步提高用戶友好性，F(xiàn)TMB系統(tǒng)的微流體平臺(tái)可以與自動(dòng)化液體處理系統(tǒng)或者手動(dòng)進(jìn)樣兼容。FTMB通過(guò)樣品擴(kuò)展和系統(tǒng)自動(dòng)化，在真菌毒素殘留物聯(lián)合檢測(cè)方面具有廣闊的應(yīng)用前景，可為食品的安全性評(píng)價(jià)和質(zhì)量控制提供新的技術(shù)支持。

審核編輯：劉清