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談到顯微成像系統(tǒng)，常常會(huì)用分辨率來(lái)評(píng)價(jià)成像能力的高低，那分辨率到底指的是什么，又怎樣計(jì)算呢？其實(shí)對(duì)于一個(gè)特定的顯微成像系統(tǒng)，分辨率要從兩個(gè)方面來(lái)考慮，一種是光學(xué)系統(tǒng)的分辨率—光學(xué)衍射極限，另一種就是成像探測(cè)器的圖像分辨率，兩個(gè)概念缺一不可，下面將對(duì)這兩種分辨率及其對(duì)成像結(jié)果的影響進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。

1、相機(jī)的圖像分辨率

我們?cè)谫?gòu)買相機(jī)的時(shí)候，常常會(huì)說(shuō)這個(gè)相機(jī)的分辨率是500萬(wàn)，800萬(wàn)，或者4k2k，這里說(shuō)的分辨率，其實(shí)指的是成像探測(cè)器的圖像分辨率，就是探測(cè)器芯片上的總像素?cái)?shù)量。

探測(cè)器芯片的另一個(gè)非常重要的指標(biāo)就是像元大小，對(duì)于sCMOS探測(cè)器來(lái)說(shuō)，一個(gè)像素的大小通常是在幾個(gè)um。以科研級(jí)熒光顯微鏡通常使用的Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS探測(cè)器為例，像素尺寸為6.5um，相機(jī)分辨率是2048x2048，如果顯微鏡的總放大倍數(shù)為10倍，那么1um的物經(jīng)光學(xué)系統(tǒng)放大為10um的像，這樣的像會(huì)由10um/6.5um=1.54個(gè)像素來(lái)顯示，用實(shí)際物體來(lái)理解，圖像中的一個(gè)像素點(diǎn)表示的實(shí)際距離為650nm，像元尺寸越小，圖像分辨率越高。

相機(jī)的圖像分辨率=2*像素大小/放大倍數(shù)，則對(duì)上面的例子來(lái)說(shuō)，相機(jī)的圖像分辨率=2*6.5um/10=1.3um。

2、光學(xué)衍射極限

這里簡(jiǎn)單介紹下什么是“普通熒光顯微鏡的分辨率”—光學(xué)衍射極限(Abbe diffractionlimit)。

圖. 光學(xué)衍射極限示意圖

如上面的簡(jiǎn)圖所示，黑色箭頭表示的物體 AB 經(jīng)過(guò)物鏡等之后在相機(jī)上成像。由于光的衍射，物體上的點(diǎn)如A、B，在相機(jī)上并不是單獨(dú)的點(diǎn)，而是一個(gè)個(gè)有一定大小的斑，被稱為夫瑯禾費(fèi)衍射斑，如右側(cè)的同心圓所示。根據(jù)光學(xué)中的瑞利判據(jù)，1873 年，德國(guó)物理學(xué)家恩斯特·阿貝（Ernst Abbe）推算出，顯微鏡能分辨的物體上兩點(diǎn) A、B 的最小距離 h 為：波長(zhǎng)/(2*N.A.)。

這個(gè)公式就是光學(xué)顯微鏡的分辨率公式，或稱為光學(xué)衍射極限。（注意此處的分辨率與通常說(shuō)的顯示器分辨率含義不同）其中，為光的波長(zhǎng)，n為物方的折射率，θ為物體與物鏡邊緣連線和光軸的夾角。也常稱為數(shù)值孔徑，簡(jiǎn)寫為NA。

目前常用的高倍物鏡NA為 1.49，所以對(duì)于可見(jiàn)光，比如波長(zhǎng) 500 納米的綠光，計(jì)算得到顯微鏡的分辨率約為 200 納米。因此可知，即使再提高物鏡的放大倍率，也不能提高顯微鏡的分辨率。而 200 納米這個(gè)數(shù)值也就通常被人稱作衍射極限。如上圖中（a）（b）（c）所示，當(dāng)兩個(gè)點(diǎn)逐漸靠近到一個(gè)程度時(shí)，我們就很難分辨該光斑是一個(gè)點(diǎn)還是兩個(gè)點(diǎn)疊加在一起了（如圖（c）），更別提其空間/立體位置關(guān)系了。

3、顯微成像系統(tǒng)的分辨率

了解了上面兩種分辨率的原理，那已知一個(gè)顯微成像系統(tǒng)的參數(shù)，就可以計(jì)算出這個(gè)系統(tǒng)的分辨率究竟是多少了。

例如：一臺(tái)生物顯微鏡，使用的物鏡為放大倍數(shù)20倍，N.A.=0.4，光路中沒(méi)有其他放大，使用的相機(jī)為Hamamatsu Flash 4.0 sCMOS，像素尺寸6.5um。探測(cè)的熒光波長(zhǎng)按550nm計(jì)算。

系統(tǒng)的光學(xué)分辨率=550nm/(2*0.4)=688nm

系統(tǒng)探測(cè)器的圖像分辨率=2*6.5um/20=650nm

比較兩者，光學(xué)分辨率較差，所以對(duì)于這臺(tái)顯微成像系統(tǒng)，xy方向分辨率為688nm。

當(dāng)然，談到顯微成像系統(tǒng)，就離不開(kāi)對(duì)樣品的討論，生物樣品特定結(jié)構(gòu)的染色密度同樣會(huì)對(duì)最終的成像分辨率有決定性的影響，這里由于篇幅原因就不對(duì)這方面做具體的展開(kāi)，后續(xù)文章中會(huì)對(duì)染料及染色密度對(duì)熒光顯微成像系統(tǒng)，特別是超分辨率成像系統(tǒng)的分辨率影響做具體的介紹。

審核編輯：湯梓紅