用SPAD 23在共聚焦顯微鏡中實現波動對比度的超分辨率

在過去的 20 年里，遠場光學顯微鏡已經跨越了以阿貝衍射極限為代表的一度難以逾越的分辨率障礙 ，開發多種成功的方法，如受激發射損耗(STED) 、單分子定位方法(PALM 和 STORM) ，結構照明顯微術(SIM)和超分辨率光學波動成像(SOFI)，這要歸功于圖像傳感器技術的改進以及單分子光譜學的巨大進步。

在這里，我們提出了一種新的顯微技術，它利用 SPAD23陣列探測器的超高時間分辨率來測量熒光波動引起的相關性。在 ISM 架構中測量的這種相關性，然后被用作具有高達 4倍增強橫向分辨率和增強軸向分辨率的超分辨率圖像的對比度。僅用幾毫秒的像素駐留時間就可以獲得高信噪比的超分辨率圖像。

單光子探測器陣列SPAD23技術源于代爾夫特理工大學和洛桑聯邦理工學院 7 年的研究工作和 6 項獨特技術。它是由23個六角形封裝的單光子雪崩二極管組成的探測器陣列(SPADs)，具有更高的靈敏度和更低的噪聲。這款單光子探測器陣列SPAD23在其寬探測譜段內擁有>50%的探測效率，<100cps的暗計數水平，且因其獨特的半導體工藝及設計實現了前所未有的填充因子＞80%。這款帶有時間標記功能（Time Tagging）的SPAD23整體尺寸只有信用卡大小，是熒光顯微和量子信息領域的理想探測工具。

得益于SPAD23單光子陣列探測器的優異性能，在與共聚焦顯微鏡搭配使用的過程中，增加了光的收集，最終獲得了更清晰、更明亮的圖像，其中還包含有關潛在分子功能、相互作用和環境的功能信息。

下圖提出了一種超分辨光學起伏圖像掃描顯微術的方案；設置在標準共焦顯微鏡的圖像平面中的針孔和單像素檢測器被替換為 23 像素的 SPAD 陣列，SPAD23單光子陣列探測器，增加了光線收集，提高了成像速度，減少了背景噪音，能夠在共聚焦顯微鏡中實現波動對比度的超分辨率。

當掃描樣品臺時，每個光子的檢測時間記錄在相連的 FPGA 電路中，并以數字形式存儲。然后分析該數據，為陣列中的每個像素對產生第二個相關圖像，產生 232個分辨率增強為 2 的相關圖像。如下圖b所示分辨率的提高可歸因于兩個因素。首先，如在 ISM 中一樣，每個小探測器的點擴展函數(PSF)是激發和其探測 PSF 的乘積。此外，從兩個這樣的 ISM PSFs 相乘得到的相關對比度實現了進一步的變窄。在對圖像進行適當的移動以使其相互重疊之后，這一過程被稱為像素重新分配，我們在空間頻率域中應用傅立葉重新加權濾波的最后階段。理論上，最終 SOFISM 圖像的 PSF 具有超過衍射極限 4 倍的橫向分辨率增強。

圖C展示了 SOFISM，對相對稀疏的單個 CdSe/CdS/ZnS核/殼/殼量子點(QDs)的樣品進行成像。除了由于衍射造成的模糊之外，標準的共焦圖像(CLSM)包含大量的噪聲，這是由于量子點的發射強度在亮和暗狀態(閃爍)之間的波動造成的。生成標準 ISM 圖像的分辨率提高了 2 倍，同時噪聲水平明顯降低，通過像素重新分配達到平均水平。或者，通過計算熒光信號的二階相關矩陣，然后重復 ISM 過程的剩余部分(像素重新分配和傅立葉重新加權),產生分辨率提高 2.5 倍的更清晰的圖像。我們注意到，這個數字低于理論預測的數字，可能是由于探測器的有限尺寸、樣品振動和其他技術方面的原因。

最后，還可以生成互相關階數高于 2 的 SOFISM 圖像；上圖C展示了來自相同場景的 4 階相關圖像，產生橫向分辨率的 4倍增 強。 在類似的實驗條件下，盡管檢測方案有些麻煩，SOFISM 已經被證明在軸向分辨率上提供了 2 倍的改進，雖然一些成熟的超分辨率技術已經被生命科學研究團體采用并取得了巨大成功，但是 SPAD 陣列技術的最新進展為可以針對特定需求提供超分辨率解決方案。SOFISM 可以提供一種實驗上簡單的方法，在合理的曝光時間內提供顯著的 3D 分辨率增強，并且沒有顯著的實驗復雜性。

對于設備定制像素，我們完全符合您的需求 - 我們喜歡挑戰！為此，我們與業內一些最優秀的供應商密切合作歡迎大家來電咨詢。

更多詳情請聯系昊量光電/歡迎直接聯系昊量光電

關于昊量光電：

上海昊量光電設備有限公司是光電產品專業代理商，產品包括各類激光器、光電調制器、光學測量設備、光學元件等，涉及應用涵蓋了材料加工、光通訊、生物醫療、科學研究、國防、量子光學、生物顯微、物聯傳感、激光制造等；可為客戶提供完整的設備安裝，培訓，硬件開發，軟件開發，系統集成等服務。

審核編輯黃宇