變構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子（Allosteric transcription factor，aTF）包含幾個(gè)大的蛋白質(zhì)家族，能夠通過結(jié)合效應(yīng)物引發(fā)別構(gòu)效應(yīng)進(jìn)而準(zhǔn)確地調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。其分子機(jī)制主要是通過小分子的結(jié)合，能夠使得DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域的構(gòu)象發(fā)生變化，使在特定的DNA結(jié)合序列上發(fā)生結(jié)合或解離。aTF是微生物工程中的重要工具，在代謝工程、生物技術(shù)和合成生物學(xué)中都有著廣泛的應(yīng)用。 最近，加拿大康科迪亞大學(xué)（Concordia University）的研究人員在《ACS Synthetic Biology》（IF=5.11）期刊上發(fā)表了一項(xiàng)重要研究成果，該團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種響應(yīng)多種芳香族和吲哚類誘導(dǎo)劑的轉(zhuǎn)錄因子生物傳感器系統(tǒng)，該方法利用空腸彎曲菌（Campylobacter jejuni）的TetR家族阻遏物CmeR，構(gòu)建了aTF基因線路，該線路可在大腸桿菌和釀酒酵母中作為水楊酸生物傳感器，同時(shí)也證明了調(diào)節(jié)CmeR的啟動(dòng)子對(duì)多種芳香和吲哚誘導(dǎo)劑也可起響應(yīng)。

研究人員一開始發(fā)現(xiàn)來自空腸彎曲桿菌的TetR家族抑制因子——CmeR，它能夠調(diào)節(jié)外排泵來響應(yīng)腸道膽汁鹽的變化，并且CmeR還被證明可以結(jié)合水楊酸和甘油，包括脂肪族、膽汁鹽和芳香族分子，具有多配體特異性。其多配體特異性引發(fā)了研究人員的興趣，他們想利用CmeR的這一特性，設(shè)計(jì)新的基因線路。 ?首先，研究人員構(gòu)建了一個(gè)基因線路，來研究大腸桿菌中能調(diào)控CmeR的誘導(dǎo)物，其中CmeR用IPTG誘導(dǎo)的Ptac啟動(dòng)子表達(dá)，第二個(gè)啟動(dòng)子P2表達(dá)綠色熒光蛋白（eGFP），該啟動(dòng)子能響應(yīng)水楊酸。

大腸桿菌中的基因線路 由于eGFP的啟動(dòng)子響應(yīng)水楊酸，如果CmeR的表達(dá)量變大，會(huì)與P2啟動(dòng)子競爭水楊酸，導(dǎo)致GFP表達(dá)降低，因此通過誘導(dǎo)CmeR的表達(dá)可以抑制熒光（即抑制eGFP的表達(dá)），而加入越來越多的誘導(dǎo)劑水楊酸，會(huì)導(dǎo)致CmeR與水楊酸結(jié)合飽和，同時(shí)激活P2啟動(dòng)子，表達(dá)更多的eGFP。當(dāng)水楊酸添加到1mM時(shí)候，eGFP的表達(dá)量是添加1mM IPTG 的情況下的5倍。通過調(diào)節(jié)IPTG和水楊酸濃度，我們可以進(jìn)一步調(diào)控eGFP的表達(dá)水平。 ?接著，研究人員探索了CmeR的配體特異性。首先將攜帶該基因線路菌株去“感受”各種芳香族、吲哚和脂肪族分子。通過觀察報(bào)告基因eGFP的熒光強(qiáng)度，來表征CmeR的響應(yīng)程度。熒光強(qiáng)度的增加范圍從1.1倍（兒茶酚）到3.8倍（植物生長素吲哚-3-乙酸或IAA），同時(shí)也利用流式細(xì)胞儀表征了這些分子的劑量-響應(yīng)，實(shí)驗(yàn)表明除了鑒定的同源誘導(dǎo)劑外，受CmeR調(diào)節(jié)啟動(dòng)子似乎也受色胺（色氨酸的胺衍生物）的最低程度誘導(dǎo)，而酪胺（酪醇的胺衍生物）不誘導(dǎo)表達(dá)。

大腸桿菌表達(dá)情況 ?之后研究人員在真核生物釀酒酵母中也實(shí)現(xiàn)了該基因線路的功能。在這個(gè)線路中，CmeR由強(qiáng)啟動(dòng)子PTDH3啟動(dòng)表達(dá)。綠色熒光蛋白（EnvyGFP）由強(qiáng)啟動(dòng)子PCCW12表達(dá)，通過修飾，使PCCW12具有水楊酸響應(yīng)性。

釀酒酵母中的基因線路 研究人員用類似于在大腸桿菌的實(shí)驗(yàn)，得到的數(shù)據(jù)也證明CmeR在釀酒酵母中充當(dāng)轉(zhuǎn)錄抑制因子，并且可被水楊酸誘導(dǎo)。并且也用相同的分子對(duì)基因線路劑量-響應(yīng)的進(jìn)一步表征，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌和釀酒酵母中CmeR誘導(dǎo)曲線之間存在差異，后者表現(xiàn)出最大的熒光誘導(dǎo)，范圍從1.8倍（乙酰水楊酸酯）到5倍（對(duì)香豆酸酯）。

釀酒酵母表達(dá)情況 釀酒酵母回路與大腸桿菌回路相比，釀酒酵母CmeR回路中對(duì)其中許多分子都起反應(yīng)，包括對(duì)同源誘導(dǎo)物水楊酸的反應(yīng)，但總體上有所減弱，這可能是由于兩種基因線路設(shè)計(jì)上差異，例如大腸桿菌是從多拷貝載體表達(dá)的，而在釀酒酵母中是單拷貝基因組整合。 ?總的來說，研究人員分別在原核生物大腸桿菌和真核生物釀酒酵母中對(duì)基于CmeR的水楊酸細(xì)胞生物傳感器進(jìn)行了構(gòu)建和表征。除了水楊酸、膽汁鹽、膽酸鹽和牛磺膽酸鹽外，還鑒定了多種芳香族和吲哚類誘導(dǎo)劑可作為大腸桿菌中CmeR的新配體。此前酪醇、色氨酸和酪胺都沒有作為aTF調(diào)節(jié)的誘導(dǎo)劑。 值得一提的是，這種多配體特異性在同一途徑中會(huì)導(dǎo)致不同分子可能存在顯著的串聯(lián)干擾，在代謝工程應(yīng)用中直接利用CmeR會(huì)受到特異性的限制。但是利用這一特性，可以將CmeR這種多配體特異性使其成為檢測分子的工具，以及定向進(jìn)化的良好靶點(diǎn)。同時(shí)，鑒于CmeR配體的雜亂性，也可以研究其他芳香族和吲哚類分子在誘導(dǎo)空腸彎曲菌抗生素抗性中是否起作用。

論文鏈接： https://doi.org/10.1021/acssynbio.2c00063

審核編輯 ：李倩