北京時間2020年11月14日，新格元創始人耶魯大學樊榮教授團隊一項新的空間高分辨率多組學研究成果在國際頂級期刊《cell》上發表，文中描述了一種基于微流體條碼標記的空間多組學測序(DBiT-seq)技術，該技術基于組織切片的空間結構，將多組學技術與高分辨率的空間信息相結合，可以達到10μm高精度水平，為空間高分辨率組學技術帶來了顛覆性的革命！

No.1

主要內容

空間轉錄組技術在一定程度上提供了基因表達空間異質性信息，但如何在大組織區域內進行高分辨率、多組學、無偏差的生物信息分析仍然是一個科學難題。耶魯大學樊榮教授團隊提出了一種全新的空間高分辨率多組學研究方法——基于微流體條碼標記的空間多組學測序(DBiT-seq)。利用DBiT-seq技術，本文分析了小鼠胚胎中早期器官發育的主要組織類型，并展示了小鼠胚胎發育中全轉錄組和22個蛋白質的空間高分辨率共作圖。基因表達和蛋白積累數據進一步確定了胚胎前腦發育和微血管網絡的差異調控模式。文章還以10μm像素的高分辨率檢測到了排列在視囊泡周圍的單層黑色素細胞。

No.2

DBiT-seq技術原理

DBiT-seq工作流程如圖所示，將含有平行微通道(寬度為10μm、25μm或50μm)的聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控芯片置于組織載玻片上，微流控通道用于將分子條形碼以空間受限的方式傳遞到甲醛固定的組織玻片表面。第一種微流控芯片通道在組織切片表面引入帶有oligo-dT的DNA條形碼A1-A50，可結合組織mRNA并啟動原位逆轉錄形成cDNAs。隨后垂直放入第二種微流控芯片通道，引入第二組標記蛋白的DNA條形碼B1-B50。A1-A50和B1-B50交叉原位連接，產生組織像素的二維拼接，每一個拼接點都包含完整條形碼AiBj的唯一組合(i=1-50, j=1-50)。通過這種巧妙的方法，可以在同一固定的組織切片上同時完成對mRNA、蛋白質，甚至其他多組學物質的條形碼標記，后續通過NGS測序結果分析，得以構建一個高分辨率多組學空間圖譜，使用過后的組織切片還可以進行成像記錄。

另外，DBiT-seq技術不僅可用于新鮮組織切片，還可用于已經固定的標準組織玻片，甚至冰凍的組織切片也可以通過轉移到聚賴氨酸包被的載玻片上，使用甲醛固定，在-80℃保存備用。

DBiT-seq的工作流程示意圖

No.3

研究結論

1、小鼠胚胎空間多組學圖譜

胚胎發育的動態變化，特別是早期不同器官的發生形成，受到時間和空間因素的精確調控，因此本文選擇了發育中的小鼠胚胎進行研究，驗證這項全新的技術。

研究將DBiT-seq技術應用于50μm像素大小的E.10完整小鼠胚胎組織切片，通過計算獲得了mRNA在每個像素中reads數繪制的空間熱圖(圖A中)，以及22個蛋白在每個像素中積累數繪制的空間熱圖（圖A右），并對相鄰組織切片進行H&E染色（圖A左）。

根據mRNA轉錄組數據結果，基于無監督聚類將小鼠胚胎細胞分為11個主要集群(圖C)，將這些細胞集群映射回空間圖譜，發現這些細胞集群與小鼠胚胎發育的主要組織類型密切相關，包括前腦、中腦、后腦、鰓弓、脊髓神經管、心、四肢芽以及主體腹側和背側內臟。研究還對13種主要組織類型進行了解剖學注釋，并根據mRNA和蛋白的平均積累量生成了組織區域特異性綜合圖表(圖E/F)，進一步發現Notch1蛋白在整個小鼠胚胎中均高表達，暗示了Notch信號在調節小鼠胚胎發育過程中起著至關重要的作用。

小鼠全胚胎空間多組學圖譜

2、胚胎大腦的高分辨率圖譜

接下來采用更高分辨率(像素大小=25μm)的DBiT-seq技術分析E.10小鼠胚胎組織樣本的腦區。Pan-mRNA map圖清晰地分辨出更多的腦部精細結構，Pan-protein map圖也開始顯示出可分辨的精細結構，且兩者都與H&E組織圖像相關(圖A、B、C)。

研究的22種蛋白中，有一半以上在小鼠胚胎腦部區域顯示出獨特的積累特征（圖D）。例如，EpCAM信號在極局部的高度界定區域，具有超高的信噪比。PECA作為一種泛內皮標記物精確地描繪出了小鼠胚胎腦微血管網絡，甚至呈現了組織學上難以區分的微血管位置。為了驗證這一結果，研究者使用免疫熒光成像技術在鄰近的組織切片上檢測EpCAM和PECA，結果顯示DBiT-seq獲得的空間圖與免疫熒光染色圖像及H&E染色圖像能夠很好的重疊在一起，在近單像素水平上顯示出驚人的完美相關性，為DBiT-seq技術的精確性提供了強有力的證明（圖E）。

小鼠胚胎大腦的高分辨率圖譜

3、胚胎早期眼睛的空間圖譜

在小鼠胚胎發育的E.10時期，眼睛的發育已達到了視囊泡晚期。利用更高分辨率的10μm微流控通道對E.10小鼠胚胎腦區進行了DBiT-seq檢測，將得到的空間圖譜與相鄰組織切片H&E染色圖譜進行比較，并對其中四個高表達的基因進行可視化分析。其中，Pax6（廣泛參與胚胎器官和組織發育）被發現在小鼠胚胎視囊泡中高度富集。另一個基因Trpm1在視泡周圍形成完美的線條。Six6是一種在脊椎動物胚胎中導致視野分化和增殖的基因，顯示在視囊泡及周邊區域表達。Pmel是色素細胞特異性基因，參與纖絲片的發育，圖像顯示這個基因圍繞著視囊泡表達。這些精美的圖像證明了DBiT-seq技術能夠高精度地解析組織中的單細胞層結構。

早期眼睛發育的空間多組學圖譜

4、空間差異基因表達分析

研究者還對小鼠胚胎E.10、E.11、E.12時期的組織樣本進行了全局聚類分析，為了更加精確地注釋組織區域，將低分辨率空間轉錄組的空間差異表達(spatialDE)分析應用于DBiT-seq的數據上。

在E.10小鼠胚胎中，許多內部器官還沒有開始發育，但基于DBiT-seq檢測已經可以確定20項組織特征，包括眼睛、耳朵、肌肉、前腦和上皮細胞等。隨著胚胎的發育，在E.12小鼠胚胎中，甚至能夠識別出40個明顯的組織特征，包括一些內部器官，如心臟、肺、泌尿生殖系統、消化系統和睪丸等。這些結果表明，DBiT-seq空間高分辨率的多組學數據結合spatialDE自動特征識別分析，可大幅提高組織分辨的精確度，有助于病理樣本檢測的準確性。

空間差異基因表達特征自動識別

No.2

研究結論

樊榮教授實驗室開發了一種全新的高分辨率(~10μm)空間多組學測序技術DBiT-seq，可同時對轉錄組、蛋白質或其他組學進行研究，利用這項技術對整個小鼠胚胎進行了空間多組學圖譜(蛋白質和mRNA)繪制，并獲得了許多新的知識。通過DBiT-seq技術檢測的轉錄組信息，可以在小鼠胚胎早期器官發生階段確定主要的組織類型，重建的空間蛋白表達譜能夠很好地解析小鼠胚胎腦組織病理圖像中難以分辨的微血管網絡，清晰地顯示視囊泡周圍的黑色素細胞單層。

DBiT-seq是一種全新的空間高分辨率多組學研究技術，由于這項技術不受組織新鮮度的限制，有潛力成為繪制一系列分子信息(蛋白質、轉錄組和表觀基因組)的通用方法。其潛在影響將是廣泛和深遠的，有望應用于許多不同領域的基礎和轉化研究，包括胚胎學，神經科學，癌癥和臨床病理學等。

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